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Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick

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Desenvolvimento e Reprodução do Mouse de Laboratório
 
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Desenvolvimento e Reprodução do Mouse de Laboratório

Overview

A reprodução bem sucedida do camundongo de laboratório (Mus musculus) é fundamental para o estabelecimento e manutenção de uma colônia animal produtiva. Além disso, os embriões de camundongos são frequentemente estudados para responder perguntas sobre processos de desenvolvimento. Uma grande variedade de ferramentas genéticas agora existem para regular a expressão genética durante o desenvolvimento embrionário e pós-natal do rato, o que pode ajudar os cientistas a entender mais sobre doenças hereditárias que afetam o desenvolvimento humano.

Este vídeo fornece uma introdução à reprodução e desenvolvimento de ratos. Além de esclarecer a terminologia utilizada para descrever a progressão do desenvolvimento, a apresentação revisa as etapas-chave do ciclo de vida do mouse. Em primeiro lugar, são descritos grandes eventos de desenvolvimento que ocorrem no útero, com especial atenção dada ao layout único dos embriões de roedores primitivos. Em seguida, protocolos de criação são fornecidos para ratos pós-natais, ou filhotes, incluindo o processo de desmasmaamento, ou remoção de filhotes da gaiola de sua mãe. Como machos e fêmeas devem ser separados nesta fase para evitar o acasalamento não programado, a demonstração também revela como determinar o sexo com o rato. Posteriormente, são dadas instruções para a realização de reprodução controlada de camundongos, incluindo a triagem para o plugue copulatório, que é útil para o desenvolvimento embrionário precisamente cronometrado. Finalmente, o vídeo destaca estratégias utilizadas para investigar os processos complexos que regem o desenvolvimento de camundongos, incluindo a geração de camundongos "nocaute" geneticamente alterados.

Procedure

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Camundongos são organismos modelos extremamente valiosos que continuam a melhorar nossa compreensão do desenvolvimento humano e da doença. Entre os mamíferos, os camundongos têm uma alta fecundidade e rápido desenvolvimento, o que significa que as colônias podem ser rapidamente expandidas.

Uma vez que o desenvolvimento dentro do útero requer algumas estruturas embrionárias especializadas, o estudo da embriogênese em um modelo mamífero também é mais relevante para os seres humanos. Neste vídeo, discutiremos as etapas de reprodução e desenvolvimento de camundongos, como criar camundongos e formas de aplicar o conhecimento reprodutivo e de desenvolvimento do camundongo em laboratório.

Primeiro vamos falar um pouco sobre reprodução do rato. Como os humanos, o desenvolvimento precoce de camundongos é interno, com a gestação ocorrendo dentro dos chifres uterinos da mãe, que é chamada de "represa". No entanto, ao contrário da maioria de nós, os camundongos carregam muitos fetos ao mesmo tempo, produzindo um tamanho médio de ninhada de 10 a 12 filhotes em um período de gestação.

Antes de discutir o desenvolvimento desses filhotes com mais detalhes, vamos rever os termos utilizados para identificar os estágios de desenvolvimento. O sistema de encenação mais comum começa no dia zero embrionário, ou E0, no dia da cópula bem sucedida. Depois disso, cada etapa é definida pelo número de dias desde a fertilização até o dia do nascimento, quando a numeração recomeça no pós-natal do dia zero, ou P0.

Uma vez que o tempo de desenvolvimento pode variar ligeiramente mesmo entre embriões do mesmo lixo, abordagens alternativas baseadas na morfologia em vez de tempo pós-fertilização, como o estadiamento de Theiler, também podem ser usadas.

Em seguida, vamos dar uma olhada mais de perto nas mudanças morfológicas que ocorrem durante essas primeiras semanas de desenvolvimento do rato.

Após a fertilização do oócito, o embrião começa sua vida lentamente, completando apenas 4 rodadas de divisão celular em seus primeiros 3 dias. No entanto, pelo E4, essas células se multiplicaram e se reorganizaram para formar uma bola compactada e oca de células conhecidas como "blastocisto". Nesta fase, as células que eventualmente darão origem ao embrião em si são todas encontradas dentro de um aglomerado de células-tronco conhecidas como massa celular interna, ou ICM. As outras células, conhecidas como células trophoblastos, se tornarão parte da placenta que fornece oxigênio e nutrição ao embrião.

Depois deste ponto, o desenvolvimento de roedores fica um pouco torcido. Na maioria dos mamíferos, as células que dão origem ao embrião formam uma estrutura semelhante a um disco. Em contraste, o embrião do mouse tem uma configuração em forma de xícara. As células do lado de fora deste copo formam uma camada celular conhecida como endoderme, que eventualmente dá origem a tecidos profundos, como o revestimento do trato digestivo. Confusamente, as células na superfície interna do copo representam o ectoderme, que forma tecidos mais superficiais, como cabelo e pele.

Este layout invertido persiste até cerca do dia 8 embrionário, quando o embrião literalmente se vira. A essa altura, algumas outras estruturas reconhecíveis se desenvolveram, incluindo os somites, que dão origem a tecidos como o músculo esquelético; e os botões dos membros, que formarão os membros da primeira e traseira.

As coisas se movem muito rapidamente daqui, com o desenvolvimento de grandes sistemas de órgãos, como os pulmões e o trato digestivo, bem em andamento até o dia 12. Notavelmente, os embriões estão prontos para sobreviver fora da mãe após apenas 19-21 dias de gestação.

Agora que você tem uma sensação de como o desenvolvimento prossegue no útero, vamos falar sobre o que acontece depois que os ratos dão à luz. Os camundongos recém-nascidos, ou filhotes, são minúsculos, sem pelos e cegos.

Durante as primeiras semanas de vida, os filhotes podem receber nutrição de qualquer fêmea lactante disponível. Então, cerca de três semanas após o nascimento, eles estão prontos para desmamar, o que significa que é hora de sair da casa da mamãe para uma gaiola própria!

Para controlar a criação futura, você precisará separar os machos e fêmeas neste momento. Para identificar os sexos, examine a distância entre o ânus e a genitália externa. No feminino, essa distância será menor do que no masculino.

Para preparar a nova casa dos filhotes, forrar uma gaiola com uma camada de roupa de cama. Uma vez que eles ainda estão se acostumando com as novas escavações, adicione algumas pelotas de comida amolecidas com água ou um prato de comida molhada no fundo da gaiola, além de fornecer água.

Os camundongos se tornam sexualmente maduros dentro de algumas semanas de desmame, com seu pico de reprodução geralmente caindo entre 2 e 9 meses de idade.

Então, como usamos essas informações para iniciar uma colônia de reprodução? Primeiro, é importante lembrar que o comportamento de um rato é significativamente impactado pelo seu ritmo circadiano; já que são noturnos, seus ratos procriarão à noite.

Feromônios também desempenham um grande papel no comportamento do rato, por isso é útil "introduzir" potenciais companheiros para que eles se conheçam melhor. Para maximizar o número de filhotes nascidos durante um ciclo de reprodução, combine um rato macho com até 4 fêmeas.

Para o desenvolvimento do embrião, retorne pela manhã para verificar cada camundongo fêmea em busca de um plugue de muco vaginal, que é depositado pelo macho durante a copulação. Ratos ovulam a cada 4- 5 dias; então, se você não ver um plugue imediatamente, mantenha os ratos juntos para outra chance no final dessa semana. Uma vez que você determinou que algumas das fêmeas estão grávidas, remova o rato macho da gaiola, pois eles podem ser uma ameaça para os filhotes recém-nascidos.

Para estudar os processos complexos que controlam o desenvolvimento de embriões de mamíferos, os cientistas desenvolveram algumas técnicas muito legais. Vamos dar uma olhada em alguns exemplos.

Para começar, o mapeamento do destino é uma abordagem em que as células são marcadas e rastreadas in vivo para determinar como elas contribuem para estruturas específicas no desenvolvimento e tecido adulto.

Aqui, a expressão de uma proteína fluorescente é ligada em uma pequena população de células para rastrear a contribuição das células que expressam a proteína para o tecido cerebral fetal e adulto.

A fim de testar o papel de um gene específico no desenvolvimento, é útil examinar o resultado de sua superexpressão. Em uma técnica chamada eletroporação utera, o DNA é entregue ao embrião por microinjeção e, em seguida, conduzido para as células, aplicando corrente elétrica através do tecido. O resultado é a indução da expressão genética em células específicas, como demonstrado pela expressão de proteína fluorescente vermelha no sistema nervoso central deste embrião.

Mudanças mais permanentes na expressão genética vêm na forma de camundongos eliminatórios, em que uma porção de um gene é removida. Para gerar esses camundongos, as células-tronco são isoladas dos embriões primitivos e submetidas à modificação do genoma. As células modificadas são transplantadas em um blastocisto, que é então implantado em uma fêmea para a gestação. O filhote resultante será uma "quimera" composta de células normais e knockdown, e pode ser criado para gerar ratos homozigos nocaute.

Você acabou de assistir a visão geral da JoVE sobre reprodução e desenvolvimento de ratos. Neste vídeo, cobrimos a reprodução do camundongo, o desenvolvimento pré-natal e pós-natal, e como criar camundongos. Também discutimos algumas aplicações interessantes para estudar o desenvolvimento de ratos no laboratório. Obrigado por assistir!

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