La identificación rápida de bacterias gram negativas de Cultura sangre caldo de cultivo utilizando MALDI-TOF espectrometría de masas

El objetivo general de este procedimiento es identificar organismos gramnegativos directamente a partir del caldo de hemocultivo utilizando la tecnología Maloff Para ello, cinco mililitros de un caldo de hemocultivo positivo se transfieren a un tubo de separación de suero y se centrifugan. Después del centrifugado, la capa de fluido que contiene bacterias se transfiere a un tubo de microcentrífuga y luego se centrifuga a baja velocidad. A continuación, el sobrenadante se transfiere a un nuevo tubo de microcentrífuga y se centrifuga a alta velocidad.

El pellet resultante se resuspende en ácido fórmico y se analiza mediante maldi para identificar las especies de bacterias presentes. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como el cultivo tradicional, es la identificación más temprana de las bacterias gramnegativas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la microbiología clínica, ya que el diagnóstico de bacteriemia influye en la elección del antimicrobiano prescrito por el clínico.

Para demostrar este procedimiento estará Leonardo Bascu, que es uno de los técnicos de nuestro departamento que realiza regularmente este procedimiento. Los frascos de hemocultivo aeróbico o anaeróbico recolectados a discreción del personal clínico, generalmente en el contexto de una enfermedad febril, se incuban en máquinas automatizadas que monitorean continuamente el crecimiento de bacterias. Cuando hay evidencia de crecimiento en un frasco de hemocultivo, la máquina identificará el frasco señalizado.

Comience este procedimiento retirando el frasco de hemocultivo señalizado de la incubadora. Colóquelo en un gabinete de seguridad biológica. Prepare una tinción de Gram a partir del caldo de hemocultivo señalizado de acuerdo con los protocolos institucionales locales y examínela por microscopía si se identifican organismos gramnegativos.

Procese el caldo de cultivo siguiendo el método descrito aquí. Si se identifican organismos grampositivos, se puede utilizar un método molecular rápido alternativo. Invierta el frasco de hemocultivo dos o tres veces para mezclar.

Luego en el gabinete de bioseguridad. Conecte una jeringa de 10 mililitros a un dispositivo de transferencia de sangre de seguridad. Conecte el dispositivo de transferencia de sangre al frasco de hemocultivo y extraiga cinco mililitros del caldo en la jeringa de transferencia.

El caldo de hemocultivo aspirado en una centrífuga de tubo separador de suero a 1,250 veces G durante 15 minutos para eliminar los glóbulos rojos. Después del centrifugado, el hemocultivo de los frascos aeróbicos muestra una clara separación de los glóbulos rojos en el fondo del tubo con la interfaz del líquido de gel que aparece como un color blanco opaco. Por el contrario, el hemocultivo del hemocultivo anaeróbico lítico aparece como un color rojo intenso en la interfaz del líquido de gel.

Debido a que los glóbulos rojos lisados, los componentes permanecen suspendidos en el sobrenadante para cualquiera de los dos tipos, aspire y deseche el sobrenadante con una pipeta de transferencia estéril, teniendo cuidado de dejar aproximadamente un mililitro de la capa leucitaria inmediatamente por encima de la interfaz del líquido de gel. A continuación, con una pipeta estéril, mezcle suavemente el último mililitro de líquido de capa leucitaria por encima de la interfaz de gel y, a continuación, transfiera todo el volumen a un tubo de microcentrífuga. Gire el nuevo tubo a 288 veces G durante 30 segundos con una pipeta de transferencia de plástico desechable de un mililitro.

Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga y deseche el tubo con el pellet. Es fundamental en este paso evitar transferir el pellet. Esto es particularmente importante en los especímenes de hemocultivo anaeróbico porque el supinato permanece pigmentado y el pellet no siempre se ve claramente.

Centrifugar la muestra a 18, 407 veces G durante un minuto y luego, con una pipeta de transferencia de punta fina, aspirar y desechar el sobrenadante para dejar la menor cantidad posible de líquido residual sin alterar el pellet. Agregue un mililitro de ADN estéril y agua libre de ARN y pipetee hacia arriba y hacia abajo para resuspender la centrífuga de pellets residual. La solución resuspendida a 18, 407 veces G durante un minuto.

Después de la centrifugación, utilice una pipeta de punta fina para aspirar y desechar el sobrenadante. Nuevamente, teniendo cuidado de eliminar la mayor cantidad de líquido posible. Resuspender el pellet en 10 microlitros de ácido fórmico al 70%.

Para gránulos grandes, puede ser necesario aumentar el volumen de ácido fórmico entre un 50 y un 100%Usando bien la mezcla de pipeta para garantizar una solución homogénea si es necesario, use la punta de la pipeta para romper físicamente el pellet. La solución resultante contiene bacterias concentradas aisladas del caldo de hemocultivo, que está relativamente libre de células humanas y de resinas de hemocultivo Utilizando una pipeta, inocule una placa objetivo TOF maldi limpia con dos microlitros de la suspensión preparada por punto objetivo. Prepare tres sitios de destino para cada muestra a fin de superar el problema ocasional de lecturas fallidas.

Coloque la placa en el borde de la campana extractora para maximizar el flujo de aire a través de ella, de modo que se seque rápidamente, superponga cada punto seco con un microlitro de solución de matriz. Deje que la placa de maldi to target se seque en el borde de la campana extractora. Al igual que antes, asegúrese de que una preparación homogénea llene cada uno de los puntos objetivo en el plato.

Inserte la placa objetivo en el espectrómetro de masas Maloff. Asegúrese de que la placa esté al ras con las placas accionadas por resorte. No inserte la placa objetivo hasta que todos los puntos objetivo estén secos.

Revise el sello de goma para asegurarse de que esté libre de pelusas, polvo y cabello. Esto permitirá crear las condiciones de vacío requeridas. A continuación, cierre la tapa del escenario maloff y luego presione el botón de entrada y salida en la parte frontal del instrumento.

La tapa se bloqueará y se creará un vacío. Abra el software de control maldi typ y flex dentro del software typ. En el menú desplegable titulado archivo, seleccione nueva clasificación, asigne un nombre al proyecto y, a continuación, seleccione nuevo.

Seleccione Siguiente. Para completar la configuración dentro de la ventana del software de control flexible, identifique el gráfico en pantalla de la placa objetivo mientras mantiene presionado el botón izquierdo del mouse. Mueva el ratón sobre los puntos inoculados y resalte los puntos objetivo que están en uso.

Utilice el botón derecho del ratón para hacer clic en cualquier lugar de las posiciones de destino seleccionadas y, a continuación, seleccione añadir analitos en el menú desplegable. Para cada uno de los puntos de destino, agregue los detalles de identificación del hemocultivo a la columna ID y haga clic en siguiente. Cuando esté completo, seleccione la base de datos de espectros de taxonomía comercial y seleccione siguiente Los laboratorios pueden utilizar bases de datos internas o comerciales adicionales para aumentar el número de espectros de referencia, haga clic en finalizar y el MALDI TOF MS comenzará a generar espectros.

Ocasionalmente, se pueden lograr puntuaciones de maldi a más altas utilizando la adquisición manual de maldi a espectros dentro del software de control de flex. Una vez que se adquieran los espectros y se complete el análisis en el software de estereotipos, seleccione el botón más junto a la identificación de especies. Para ampliar la lista de identificación de cada objetivo, estudie las cinco identificaciones principales observando si las cinco principales son similares.

Si los cinco géneros principales son discordantes con puntuaciones mayores o iguales a 1,7 para el mismo punto objetivo, puede haber una mezcla de especies. Tenga en cuenta que la tecnología OV tiene poca sensibilidad para la detección de especies mixtas. Cuando se observa una puntuación mayor o igual a 2,0 para la coincidencia más alta en un punto objetivo, informe la especie cuando la puntuación más alta en un punto objetivo sea mayor o igual que 1,7, pero menor que 2,0, informe el gen.

Solo si los criterios adicionales de las cinco identificaciones principales son concordantes, informe al nivel de la especie. Cuando todos los espectros estén completos, presione el botón de entrada y salida en el MALDI para mecanizar, abra el receptáculo de la placa objetivo y retire la placa. Si se utiliza una placa objetivo maldi TOF reutilizable, use alcohol para limpiar todos los puntos objetivo y almacene el maldi en la placa a temperatura ambiente una vez que esté limpio y seco para identificar las bacterias gramnegativas del caldo de cultivo sanguíneo, se emplearon ciclos de lavado por centrifugado para concentrar y aislar las bacterias, que luego se analizaron mediante espectroscopia de masas MALDI Tof.

Como se describe en este artículo de video, aquí se muestran los espectros generados por MALDI TOF MS para eureka coli con una puntuación logarítmica de 1,86. Uno a la derecha son las primeras cinco coincidencias identificadas por el software de escritura. Nótese que la especie se reporta consistentemente como re coli con una puntuación de 1.861.

Dado que las cinco principales coincidencias son E. coli, la identificación se considera confiable a nivel de especie. Aquí se muestran los espectros generados por MALDI a MS para el aerógeno de Pseudomonas. La puntuación logarítmica es de 2,216, a la derecha están las primeras cinco coincidencias identificadas por el software de escritura.

Nótese que la especie se reporta consistentemente como pseudomonas aerogen con una puntuación alta de 2.216. La identificación se considera confiable a nivel de especie. Los espectros generados por MALDI a MS para un caldo de hemocultivo mixto que contiene esia coli y SIO marsens se muestran aquí a la derecha las primeras cinco coincidencias del software de tipificación, que informa tanto de Reiki coli como de SIO marsan.

En los primeros cinco espectros coincidentes. Este gen mixto solo se identifica en aproximadamente un tercio de los cultivos de caldo mixto. Esta tabla resume los resultados previamente publicados del estudio de verificación de este método en el que el 91,8% de los caldos monomicrobianos lograron una puntuación de maldi a menos de 1,7 con 100% y 97% de concordancia con el genio y la especie respectivamente.

Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo preparar un frasco de hemocultivo señal para la identificación usando maldi toff. Siguiendo este método, podemos utilizar el mismo pellet preparado para la identificación bacteriana para preparar un inocular más estandarizado para las pruebas de susceptibilidad automatizadas. Por ejemplo, esta técnica permite a los laboratorios proporcionar un diagnóstico precoz a los clínicos con un potencial de impacto en el tratamiento.

No olvide que trabajar con frascos de hemocultivo puede ser peligroso y siempre se deben usar precauciones, incluido un gabinete de seguridad biológica, al manipular frascos de hemocultivo.