Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק תיקון
 
Click here for the English version

אלקטרופיזיולוגיה של מהדק תיקון

Overview

קרום תאי נוירון מאוכלסים ערוצי יונים השולטים בתנועת המטען לתוך ומחוץ לתא, ובכך מווסתים ירי נוירונים. טכניקה שימושית מאוד אחת לחקירת התכונות הביופיסיות של ערוצים אלה נקראת הקלטת מהדק תיקון. בשיטה זו, מדעני מוח מניחים מיקרופיפט זכוכית מלוטשת על תא ומחילים יניקה כדי ליצור חותם התנגדות גבוהה. תהליך זה מבודד "תיקון" קטן של ממברנה המכילה ערוץ יונים אחד או יותר. באמצעות אלקטרודה בתוך micropipette, החוקרים יכולים "להדק" או לשלוט על המאפיינים החשמליים של הממברנה, אשר חשוב לניתוח של פעילות הערוץ. האלקטרודה מאפשרת גם שינויים במתח על פני הממברנה, או זרימת היונים דרך הממברנה, להיות מתועד.

וידאו זה מתחיל בסקירה כללית של העקרונות שמאחורי אלקטרופיזיולוגיה של מהדק תיקון, מבוא לציוד הדרוש, ותיאורים של תצורות התיקון השונות, כולל תאים שלמים, מחוברים לתאים, מחוררים, מבפנים החוצה, ותיקונים חיצוניים. לאחר מכן, השלבים העיקריים של ניסוי מהדק תיקון תא שלם טיפוסי מפורטים, שבו נוצרת עקומת מתח זרם (IV). לבסוף, יישומים של הקלטת מהדק תיקון מסופקים כדי להדגים כיצד המאפיינים הביופיסיים של ערוצי יונים, עירור תאים, ותרכובות נוירואקטיביות מוערכים במעבדות נוירופיזיולוגיות היום.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הקלטת מהדק תיקון היא טכניקה שימושית ביותר לחקירת התכונות הביופיסיות של ערוצי היון השולטים בהפעלה העצבית.

ההליך כרוך בלחיצת מיקרופיפט זכוכית על תא על מנת לבודד "תיקון" קטן של ממברנה המכילה תעלות יונים אחת או יותר.

ההתקנה הניסיונית מאפשרת עוד יותר למדענים "להדק" את הסביבה החשמלית של האזור המוטל על ידי שליטה מדויקת במתח על פני קרום התא, אשר, בהתאם לערוצי היונים הקיימים, משפיע על זרימת היונים דרך הממברנה ומאפשר מחקר מורכב של ערוצים אלה.

וידאו זה מציג סקירה של העקרונות שמאחורי טכניקת מהדק התיקון, תיאור של השלבים הדרושים להפעלת ניסוי, ולבסוף חלק מהיישומים של שיטה זו.

ראשית, בואו נסקור את העקרונות מאחורי הקלטת מהדק תיקון.

מספר היונים החיוביים והטעונים שלילית בתוך נוירון שונה מהמספר שנמצא בחוץ.

חוסר איזון זה מייצר הפרש מתח, או פוטנציאל ממברנה, של כ -70 mV, כלומר החלק הפנימי הוא שלילי יותר מאשר בחוץ.

ערוצי יון מסייעים לשמור על השיפוע על ידי שליטה על תנועת היונים על פני קרום התא, שהם למעשה זרמים חשמליים.

באמצעות טכניקת מהדק התיקון, מדענים שואלים שאלות על אופי הפוטנציאל והזרם.

אסדת המהדקים כוללת מיקרופיט זכוכית, המכיל גם תמיסה יונית וגם אלקטרודה כסופה כלור למדידת מתחים וזרמים.

קצה המיקרופיט כולל פתח מיקרון מלוטש אחד המקיף שטח קטן של ממברנה.

כדי למנוע רעשי רקע מיונים בתוך פתרון האמבטיה, נוצר חותם עמידות גבוהה בין הפיפטה לתיקון הממברנה. מכיוון שההתנגדות של החותם נמצאת בטווח הג'יגאוהם, היא ידועה כחותם ג'יגאוהם.

האלקטרודה בתוך הפיפטה מחוברת למגבר שיכול להגביר את תנודות הזרם והמתח שהן תוצאה של תנועת יונים דרך ערוצים בקרום הפלזמה.

עם המגבר, מדענים יכולים להדק או להגדיר באופן מלאכותי את פוטנציאל הממברנה במתחים ספציפיים.

המגבר מווסת כמה זרם יש להוסיף דרך אלקטרודה כסף על מנת לשמור על קבוע המתח.

מכיוון שערוצי יונים שונים מגודרים במתחים ספציפיים, אירועי הפתיחה מיוצגים על ידי הווריאציות בפרופילים של הזרמים הנמדדים.

לחלופין, מדענים יכולים לכפות זרם מסוים דרך האלקטרודה ולתעד את השינויים הנובעים מהפוטנציאל. בפוטנציאל פעולה זה של פעולת תצורה "מהדק נוכחי" ניתן לרשום פוטנציאלי פעולה.

בואו נסתכל עכשיו על חמשת הסוגים העיקריים של תצורות מהדק תיקון.

הראשון הוא התצורה המחוברת לתא שבו micropipette הוא פשוט אטום לממברנה של תא שלם.

השני הוא תצורת התא כולו שבו הממברנה בתוך micropipette נקרע כדי לספק גישה לפנים של התא.

השלישית היא תצורת התיקון המחוררת. כאן, כימיקלים כגון אנטיביוטיקה מתווספים micropipette לעשות חורים קטנים בממברנה מתן גישה ציטוסול.

התצורה הרביעית היא התיקון מבפנים החוצה. כדי להשיג זאת, micropipette תחילה יוצר חותם עם התא, לאחר מכן הוא משך בחזרה במהירות, קורע חתיכה של הממברנה את וחושף את פני השטח הפנימיים לתמיסת האמבטיה.

זה מאפשר לצד הציטופלסמי של הערוצים להיחשף לכימיקלים שונים החלים על האמבטיה.

לבסוף, בדומה ל- Inside-out, התיקון החיצוני מתחיל כתצורה של תא שלם. המיקרופיפט נסוג לאט עד שחתיכת ממברנה יוצרת חותם קמוס על הקצה.

במערך זה, הפנים החוץ תאיות של הערוץ יכולות להיחשף לטיפולים ניסיוניים.

עכשיו שבדקנו את העקרונות, בואו נעבור על השלבים הנדרשים לבצע הקלטת מהדק תיקון.

התחל על ידי משיכת צינור זכוכית בורוסיליקט לתוך micropipettes באמצעות פולר פיפטה.

לאחר מכן, אש ללטש את הקצה כדי לקבל את הקוטר המתאים והתנגדות.

לאחר ליטוש, למלא את micropipette עם פתרון יוני להעיף בעדינות כדי לפרוק את כל בועות אוויר.

ואז להחליק את micropipette מעל האלקטרודה מחובר למחזיק.

לאחר חיבור, השתמש במזרק כדי להפעיל לחץ חיובי על הפיפטה, אשר מונע פתרונות אחרים מלהיכנס לקצה.

עכשיו, למקם את התאים או רקמת העניין שלך על שלב המיקרוסקופ ולהזיז את micropipette לכיוון תא.

עם המגבר יצירת פולסים מתח בדיקה, להקליט את ההתנגדות, אשר יגדל ברגע שהקצה נוגע בתא.

כדי ליצור את חותם הג'יגאוהם, עברו בעדינות מלחץ חיובי ללחץ שלילי באמצעות המזרק. היווצרות החותם תגרום לעלייה מהירה בהתנגדות ליותר מ-1 ג'יגה אום.

עכשיו, לאחר שנקבעה תצורה של תאים, בואו נמיר לתצורת תא שלם ונעשה ניסוי!

זכור כי תצורה של תא שלם היא כאשר הממברנה נקרעת.

הקרע מתבצע על ידי הוספת לחץ שלילי למיקרופיט.

ברגע שהממברנה נשברת, צורת פעימת הבדיקה תהיה ארעית זרם גדול, כמו קרום התא פועל כעת קבל, אשר טעון על ידי פעימת הבדיקה.

המאפיינים של סוג ערוץ יונים יחיד בכל נוירון נתון ניתן לחקור על ידי חסימת הפעילות של סוגים אחרים ערוצים פרמקולוגית.

פרוטוקול שלב מתח משמש לבחינת זרמי ערוץ היונים המעוררים על ידי דריכה של המתח לסדרה של פוטנציאל החזקה שונה.

עקומת המתח הנוכחי או העירוי מציגה את התלות במתח של הזרם הזורם דרך ערוץ יונים ומספקת תובנה לגבי המתחים שבהם הערוץ פתוח או סגור.

בואו עכשיו להסתכל על כמה יישומים כדי לחקור מה מדעני מוח יכולים לעשות עם טכניקה זו.

לפעמים, ערוצי יונים שנמצאו בנוירונים ניתן ללמוד בסביבה לא תאית.

כאן מדענים הוסיפו חלבונים ערוץ יונים לקרום שומנים מלאכותי על מנת ללמוד ערוצים אלה בבידוד.

לאחר מכן ערוצים אלה יכולים להיחשף למולקולות ניסיוניות, כמו קפסאיצין שמקורו בפלפל חריף, כדי לחקור את השפעתם על פעילות הערוץ.

מכיוון שהם חשופים לסביבה חוץ-תאית ומשפיעים באופן משמעותי על תפקוד התאים, ערוצי היונים מהווים מטרות סמים מצוינות. כאשר תרכובות בדיקה מתווספות לפתרונות micropipette או אמבטיה, הקלטות מהדק תיקון ניתן להשתמש כדי לבדוק ישירות את ההשפעה של תרופות, כמו ניקוטין, על פעילות עצבית. העיקרון של הפעלת לחץ שלילי כדי ליצור חותם התנגדות גבוהה אפילו הוחל לבנות התקני תפוקה גבוהה, אשר יכול להקליט מתאים רבים בו זמנית עבור יישומי הקרנת סמים.

מהדק תיקון תא שלם הוא כלי בעל ערך למדידת התגובה של תאים בודדים לגירויים.

יתר על כן, הקלטות מזווגות ניתן להשתמש כדי לחקור את ההשפעה של נוירון ירי על תאי יעד נרגשים, כמו שריר. בדוגמה זו, מהדק תיקון תא שלם משמש כדי לעורר ירי של נוירון מוטורי, בעוד הקלטות נלקחות בו זמנית מסיבי השריר הוא שולט. יחסים ברורים בין עירור עצבי ופעילות שרירים נצפים.

הרגע צפיתם בהקדמה של JoVE להקלטת מהדק תיקון שבה נבדקו העקרונות שמאחורי הטכניקה והצעדים בהפעלת ניסוי.

עם הרגישות הזמנית המעודנת שלה לשינויים במתח ובזרמים, הקלטת מהדק תיקון תמשיך להיות אינסטרומנטלית בהבנת הביופיסיקה של ערוצים ונוירונים.

תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter