T hücrelerinin türetilmesi İn Vitro Fare Embriyonik Kök Hücreleri

Bu prosedürün genel amacı, T hücrelerinin fare embriyonik kök hücrelerinden veya e ESC'lerinden in vitro olarak kantitatif farklılaşmasını sağlamaktır. Bu, ilk olarak ESC'lerin OP dokuz stromal hücrelerden oluşan bir tek tabaka üzerine tohumlanmasıyla gerçekleştirilir. Beş ila yedi gün sonra, mezodermal benzeri koloni oluşumları hasat edilir ve taze bir OP dokuz hücreli tek tabaka üzerine yeniden kaplanır.

Üç gün sonra, küçük yuvarlak hematopoietik progenitör hücreler veya HPC'ler hasat edilir ve eritroid, monositik ve B hücrelerinin üretilmesi için taze bir OP dokuz tek katmanına veya T hücreleri oluşturmak için taze bir OP dokuz DL bir tek katmana aktarılır. Sonuç olarak, bu yöntem, hematopoez ve t lenfosit gelişimini düzenleyen moleküler, genetik ve hücresel olayları incelemek için in vitro bir model olarak kullanılabilir. Bu prosedür Toronto Üniversitesi'ndeki Dr.Juan Carlos Sunga Fluker'ın laboratuvarında geliştirilmiştir.

Bu tekniği onun grubundan öğrendik, böylece Hunter Koleji'ndeki T hücresi gelişimi sırasında gen regülasyonu üzerine yaptığımız araştırmalara uygulayabildik. Bu tekniğin mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, hayvanlar kullanılmadan hücre dizileri kullanılarak T hücresi gelişiminin deneysel olarak manipüle edilmesine ve gözlemlenmesine izin vermesidir. 50.000 fare ESC'sini plaka başına 10 mililitre OP dokuz ortamda seyrelterek başlayın.

Daha sonra, eski ortamı OP dokuz kültür plakasından çıkardıktan sonra, ESC süspansiyonu, hücreleri eşit şekilde dağıtmaya ve hücreleri beşinci günde 37 santigrat derecede inkübe etmeye özen gösterir. Kolonilerin% 80 ila 90'ı görünür mezoderm benzeri morfoloji gösterdiğinde, ortamı ko-kültür kaplarından aspire edin ve hücreleri dört mililitre PBS'de girdapla yıkayın. Daha sonra, hücreleri yaklaşık beş dakika sonra 37 santigrat derecede dört mililitre nokta% 25 tripsin ile ayırın, hücre tek tabakasını kuvvetli pipetleme ile parçalayın, homojen çoğunlukla tek hücreli bir süspansiyon elde edilene kadar aşırı hava kabarcıkları oluşturmamaya dikkat edin.

Daha sonra hücreleri dört mililitre tam OP dokuz ortamla karıştırın ve 10 santimetrelik yeni bir boş kaba koyun. 30 dakika sonra, yapışmayan işlem yapmayan dokuz hücreyi 40 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Daha sonra kabı altı mililitre PBS ile nazikçe yıkayın ve aynı süzgeçten geçirin.

Bağlı OP dokuz hücreyi geride bırakarak. Toplanan hücreleri 400 Gs ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca döndürün ve peleti üç mililitre tam OP dokuz ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri saydıktan sonra, ortamı en uygun şekilde birleşen OP dokuz kültüründen çıkarın ve 500.000 hücreyi 10 mililitrelik bir son hacimde OP dokuz plakalarına tohumlayın.

Her analiz zaman noktası için, daha sonra her bir ko-kültürü mililitre insan rekombinant fit üç ligand başına beş nanogram ile destekleyin ve plakaları inkübatöre yerleştirin. Sekizinci günde kokültürleri mikroskop altında gözlemleyin. Hematopoietik progenitör hücrelerin veya HPC'lerin parlak kümeleri, op dokuz tek tabakasına gevşek bir şekilde bağlanmalıdır.

OP dokuz tek tabakayı pipet ve tabak üzerindeki mevcut ortamla yıkayarak bu hücrelerden mümkün olduğunca çok toplayın. Tek tabakayı aşırı bozmamaya dikkat edin. Köpürmeyi önlemek için, pipetin ucunda her zaman en az bir mililitre ortam bulundurun.

Toplanan hücreleri 40 mikrometrelik bir süzgeçten süzün ve ardından plakayı sekiz mililitre PBS ile durulayın. Mikroskop altında tüm HPC'lerin toplandığını onaylayın ve ardından PBS yıkamasını aynı plakadan hücreleri içeren tüpe süzün. Hücreleri resüsle döndürdükten sonra, peleti taze hazırlanmış uyum ile desteklenmiş OP dokuz ortamında askıya alın

Üç ligand ve IL yedi içeren ana hücreleri, uygun hücrelerle kaplanmış altı oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarında her bir plakadan karıştırır ve inkübe eder. 10. günde, aynı ESC klon besleyici hücre tipi kombinasyonunu içeren altı kuyulu plakanın her bir oyuğundan ortamı yavaşça çekin. Ardından, plakanın her bir kuyucuğuna iki mililitre taze OP dokuz medya ana karışımı ekleyin.

Toplanan ortamı gönderdi ve her peleti kuyucuk başına bir mililitre taze OP dokuz ortam ana karışımı içinde yeniden süspanse etti. Daha sonra, hücrelerin bir mililitresini her bir oyuğa geri dağıtın ve bulaşıkları 12. günde inkübatöre geri koyun, tek hücre süspansiyonuna benzeyen bir durum elde edilene kadar tek tabaka da dahil olmak üzere tüm hücreleri ayırmak için her bir oyuktaki mevcut ortamı kuvvetlice pipetleyin. Sonra her bir kuyu içeriğini süzün ve sadece gösterildiği gibi yıkayın.

Aynı ESC klon besleyici hücre tipi kombinasyonunu içeren birden fazla kuyudan gelen hücrelerin birleştirilmesi. Son olarak, o gün buz üzerinde yapılacak daha fazla analiz için hücre süspansiyonunun alikotlarını yerleştirin. Ve sonra geri çekilmek için hücrelerin geri kalanını aşağı doğru döndürün.

12. günde, OP dokuz tek tabakasında farklılaşan canlı kapılı hücrelerin akış sitometrisi analizi, eritroid ve monositik soy hücrelerini ve erken CD dört CDH çift negatif veya DN'nin ortaya çıkışını ortaya çıkaracaktır. Evre T soy hücreleri, 16. güne kadar OP dokuz DL bir tek katmanlı DN bir ve DN iki popülasyonu olarak adlandırılır. Kültürlerdeki küçük yuvarlak parlak hücrelerin miktarında önemli bir artış vardır. OP dokuzda, DL birlerde, T soy farklılaşma ürünleri, DN üç ve DN dört aşamasına ilerledi, OP dokuz hücre üzerine oturan hematopoietik progenitör hücreler, 16. günde CD 19 pozitif B hücreleri verir.

OP dokuz DL bir fare ESC ko-kültürünün 20. gününde, büyük miktarlarda CD dört, CD sekiz, çift pozitif T hücreleri ve CD sekiz tek pozitif T hücreleri mevcut olacaktır. Bu videoyu izledikten sonra, kütle embriyonik kök hücrelerden T hücrelerini ve diğer hematopoietik hücre tiplerini türetmek için gereken üç tip hücre toplama ve transfer adımının yanı sıra bu adımların her birinde ko-kültürün mikroskop altında nasıl görünmesi gerektiğini iyi anlamış olmalısınız. Tanıtılmasından sonra, bu teknik, immünoloji alanındaki araştırmacıların hematopoezde genlerin rolünü, T hücresi gelişimini etkileyen mikroçevresel ipuçlarını ve T hücresi genlerinin düzenlenmesini incelemeleri için yeni yollar açtı.

Resmi olarak yalnızca tüm fare modelleri kullanılarak ulaşılabilen sorular.