Produção e Uso de Lentivírus a seletivamente transduzem Primária Oligodendrocyte células precursoras para In Vitro Os ensaios mielinização

O objetivo geral deste procedimento é manipular viralmente células precursoras de oligodendrócitos ou OPCs para expressar proteínas de interesse. Para o estudo in vitro da nação de mielinização do SNC, isso é realizado primeiro clonando um vetor lentiviral. Os próximos passos são produzir o lentivírus e determinar a concentração viral ideal para o experimento.

Em seguida, OPCs dissecados e cultivados são transduzidos com o lentivírus. A etapa final é semear os OPCs transduzidos em neurônios cultivados dissecados do DRG. Em última análise, as coculturas mielinizantes são avaliadas quanto à expressão da proteína mielina por análise de western blot e visualizadas para a formação de segmentos axonais mielinizados por imunocoloração.

A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como ferramentas farmacológicas, é que a abordagem lentiviral nos permite superexpressar seletivamente o tipo selvagem ou as proteínas mutantes em nosso tipo de célula desejado, como neste caso, oligodendrócitos Em preparação clone os 2K necessários sete vetores emprestados, conforme descrito no protocolo de texto na manhã do dia da transfecção, preparar 32 milhões de células T HEK 2 93 num balão T 1 75 contendo 25 mililitros de meio. Criticamente, essas células devem ser presas antes da transfecção, portanto, coloque-as em placas mais cedo, se necessário. Em um tubo Falcon de 50 mililitros, prepare uma mistura principal para a transfecção do frasco T 1 75 conforme detalhado na tabela um, adicione DNA ao vórtice DMEM quente e, em seguida, adicione PEI estéril por último para evitar precipitação prematura.

Misture bem invertendo o tubo três ou quatro vezes e, em seguida, incube a mistura por cerca de 15 minutos na bancada. Troque o meio nas células e adicione a mistura de transfecção. O DROPWISE mistura suavemente o meio sobre as células e, em seguida, incuba as células durante a noite.

No dia seguinte. A expressão de GFP pode ser verificada por microscopia de fluorescência. 48 horas após a transfecção, colete o primeiro lote de sobrenadante viral e adicione 25 mililitros de meio fresco às células.

Centrifugue o sobrenadante viral a 1.140 Gs por 10 minutos a quatro graus Celsius. Transfira o sobrenadante viral sem o pellet de detritos celulares para um novo tubo e armazene-o a quatro graus Celsius. No dia seguinte, 72 horas após a transfecção, colete o último lote de centrífuga sobrenadante viral para remover os detritos celulares e agrupar com o primeiro lote de sobrenadante viral eliminado.

Em seguida, concentrar o vírus centrifugando o sobrenadante viral a 170 000 Gs durante 90 minutos. A quatro graus Celsius. Descarregue a ultracentrífuga e despeje o sobrenadante, deixando um palato de PEI precipitado e o vírus, que não é visível no fundo do tubo de 30 mililitros.

Repita este processo. Centrifugação de todos os supernat virais em lotes nos mesmos tubos de 30 mililitros para concentrar o vírus e ressuspender o vírus em cada tubo de ultracentrífuga. Adicione 500 microlitros de mídia Sato e cubra o tubo com filme.

Em seguida, agite o tubo por 30 segundos e desaloje mecanicamente o pellet com uma ponta de pipeta. Repita este ciclo de desalojamento de vórtice cerca de seis vezes para garantir que o pellet esteja totalmente suspenso no meio Sato. Agora junte todo o vírus ressuspenso em Sato em um novo microtubo.

Gire brevemente o sobrenadante acumulado na velocidade máxima por um minuto. Para granular, o PEI coleta o sobrenadante que contém o vírus e filtra passando a solução por um filtro de 0,45 mícron usando uma seringa para embrulhar. Aliquotar o vírus purificado em Sedia em volumes de 2050 e 100 microlitros e armazená-los todos a 80 graus Celsius negativos.

Para este protocolo, ter células precursoras primárias de oligodendrócitos. OPCs cultivados em placas de 10 centímetros com 10 mililitros de sédios contendo os seguintes fatores de crescimento, C-N-T-F-P-D-G-F-N NT três, e para as células devem ter sido cultivadas por 24 horas sob 8%Dióxido de carbono. Comece aspirando a mídia e remova-a completamente.

Em seguida, substitua-o por 10 mililitros do mesmo meio com os fatores de crescimento. Infecte seus OPCs com lentivírus, expressando a proteína de interesse, adicionando o volume necessário de vírus gota a gota na mídia. Também em uma placa OPC separada, misture o lentivírus de controle que expressa apenas GFP na cultura de mídia, as células por mais 48 horas.

Em seguida, colete os OPCs das placas para semear nos neurônios GRG cultivados. Primeiro enxágue cada placa com oito mililitros de EBSS duas vezes. Prepare um mililitro de tripsina EDTA 0,05% com nove mililitros de EBSS quente.

Adicione cinco mililitros da tripsina diluída a cada placa. Incube a 37 graus Celsius por até dois minutos. Neutralize a tripsina adicionando cinco mililitros de 30% de FBS em EBSS.

Em seguida, usando uma pipeta de 10 mililitros. Lave os OPCs da superfície da placa. Gire a placa um quarto de volta de cada vez para coletar todas as células.

Transferir a suspensão celular para um tubo de 15 mililitros. Centrifugue as células à temperatura ambiente durante 15 minutos a 180 Gs.Aspirar agora o sobrenadante e resus. Suspenda o pellet celular em um mililitro de meio saddo quente sem fatores de crescimento e conte as células.

Em seguida, prepare os neurônios DRG que são cultivados nas lamínulas de 22 milímetros, aspirando completamente o meio de sua placa. Em seguida, semeie suavemente 200.000 OPCs gota a gota em cada lamínula. O volume de semeadura deve ser inferior a 200 microlitros por lamínula.

Deixe as células assentarem sem mover a placa Após 10 minutos, cubra cada poço com um mililitro de água quente. Agora reproduza os OPCs irmãos restantes. Com fatores de crescimento contendo som, eles podem ser usados posteriormente para verificar a expressão da proteína de interesse.

Uma bandeira marcou quinase relacionada ao sinal extracelular. Uma construção foi usada para restrição de produção de lentivírus Enzimas foram usadas para verificar a construção da embalagem e a construção acessória para determinar a diluição ideal do vírus a ser usada nos OPCs. O lentivírus IR um foi titulado em células T HEK 2 93 em uma faixa de diluição viral para células T HEK 2 93.

Os níveis de expressão do gene de interesse aumentaram com o tempo. Em seguida, OPCs purificados foram infectados e cultivados por pelo menos dois dias para garantir a expressão do transgene. Os níveis de FLAG e GFP foram confirmados em OPCs irmãos.

Os OPCs foram então assentados nos neurônios DRG. As OPCs então se diferenciaram em oligodendrócitos e, conforme avaliado por westerns, começaram a expressar proteínas de mielina. Alguns oligodendrócitos maduros mielinizados, que foram visualizados por axônios de coloração MBP, foram corados por neurofilamento ou beta três tubulina para garantir que as densidades dos axônios fossem levadas em consideração.

Ao analisar os níveis de mielinização Depois de semear os OPCs, é importante cultivar. Os APCs irmãos. Dessa forma, a proteína de interesse ou a marca na proteína de interesse, essa expressão pode ser verificada nas APCs irmãs se não puder ser verificada na co-cultura.