Método para la Evaluación de los efectos de un rango de longitudes de onda e intensidades de / Terapia de luz del infrarrojo cercano Red sobre el estrés oxidativo In Vitro

El objetivo general del siguiente procedimiento es evaluar los efectos de una gama de longitudes de onda e intensidades de la terapia con luz roja infrarroja cercana sobre el estrés oxidativo in vitro. Para ello, hemos desarrollado un método novedoso de entrega de luz en el que podemos manipular la longitud de onda y la intensidad emitidas. Montamos una fuente de luz de xenón o banda ancha en una carcasa sobre una base de metal, luego colocamos una lente de recubrimiento, un filtro de agua y una apertura de entrada frente a la luz.

El siguiente paso del procedimiento es guiar la luz generada por la fuente de luz de banda ancha a través de la guía, la apertura y la luz líquida de entrada y a través de una segunda lente de recubrimiento. A continuación, se colocan filtros de ancho de banda y densidad neutra para obtener la longitud de onda y la intensidad de la luz deseadas. Tenga en cuenta que los filtros permiten el paso de un rango estrecho de longitudes de onda denominado banda de onda.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes de administración de terapia de luz roja infrarroja cercana, como los LED o los láseres, es que permite una manipulación precisa y calibrada de los parámetros de longitud de onda e intensidad. Esto nos permite optimizar la entrega de luz para obtener los mejores resultados biológicos que el estudio actual administra a las células disociadas. Además, también se puede aplicar a otros sistemas como los organotípicos, modelos de neurotrauma.

Cuando trabaje con cualquier fuente de luz de banda ancha brillante, asegúrese de no mirar directamente a la fuente de luz, ya que puede provocar daños visuales permanentes. Para preparar el aparato de suministro de luz, conecte una fuente de luz de banda ancha, como una lámpara de xenón o tungsteno, a una fuente de alimentación adecuada. Coloque una lente de intercalación frente a la fuente de luz para producir un haz de luz intercalado.

Haga pasar la luz a través de un filtro de calor líquido para eliminar la mayor parte del calor del haz de luz. Coloque una lente de intercalación frente a la fuente de luz para producir un haz de luz intercalado. Haga pasar la luz a través de un filtro de calor líquido para eliminar la mayor parte del calor del haz de luz.

Dependiendo de la aplicación, enfoque el haz intercalado en la estructura de entrada de una guía de luz líquida para proporcionar una entrega más flexible de la luz. En el otro extremo de la guía de luz líquida, coloque una segunda lente de recubrimiento y luego un soporte para los filtros de interferencia y densidad neutra. Esta disposición debe producir un punto de luz iluminado uniformemente de la banda de onda e intensidad deseadas.

Es posible que la distancia entre el extremo de la guía de luz y el plano de la muestra deba variar según el área que se deba iluminar. Es importante recordar que, de acuerdo con la ley del cuadrado inverso, a medida que aumenta la distancia desde el extremo de la guía de luz, la intensidad de la luz disminuirá en el presente estudio. Esta distancia es de 14 centímetros, lo que da como resultado la producción de una sección transversal de haz que ilumina uniformemente un área de tres por tres pocillos en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos.

Asegúrese de que la luz parásita de la lámpara y los componentes ópticos asociados no pueda llegar a otros especímenes, por ejemplo, utilizando cartón negro. Una vez que el dispositivo esté construido, encienda el enfriador de agua para el filtro de calor líquido y asegúrese de que haya un intercambio de agua a través de la camisa del filtro. Encienda la fuente de alimentación de la lámpara y espere al menos cinco minutos para que la fuente de luz de banda ancha.

Para estabilizar, seleccione un filtro de interferencia de banda estrecha para generar la banda de onda de iluminación deseada. Mida la luz producida por la lámpara en el plano donde se colocará la muestra. Durante el tratamiento.

La luz se mide utilizando una sonda de irradiancia calibrada conectada a un espectro adecuado. Radiómetro. Utilice filtros de densidad neutra para ajustar la intensidad de la luz hasta obtener la salida deseada. En el presente estudio, la intensidad de la luz que pasa por cada filtro de interferencia se ajusta para dar una salida cualitativa igual en cada una de las cuatro bandas de onda de tratamiento.

El método de administración de terapia de luz roja infrarroja cercana descrito se puede aplicar a cualquier tipo de célula o sistema modelo in vitro. Aquí mostramos nuestra técnica de entrega de luz a las células utilizando feocromocitoma o células PC 12. Por ejemplo, células de cultivo en medios de crecimiento.

En 96, las bandejas de pocillos recubiertas con poliol lisina hasta que tienen un 70 a 80% de confluente. Prepare la concentración deseada de glutamato o estresor alternativo en medios de cultivo de crecimiento completo. Aquí usamos glutamato de 10 milimolares.

Retire el medio de las células y lávelas suavemente tres veces con solución salina tampón de fosfato. Después del lavado, agregue medios que contengan glutamato hasta un volumen total de cien microlitros por pocillo. Inmediatamente después de la adición de glutamato o el factor estresante de elección, exponga las células a un tratamiento de luz a las longitudes de onda e intensidades deseadas colocando la placa de cultivo debajo del aparato de suministro de luz preparado.

Asegúrese de modificar la salida cualitativa del haz de luz utilizando las combinaciones establecidas de filtros de densidad neutra. Dependiendo de la longitud de onda que se administre. Una vez finalizado el tratamiento de luz, coloque las células en una superficie nivelada e incube a 37 grados centígrados en condiciones reguladas por dióxido de carbono durante 24 horas.

También se pueden administrar dosis adicionales de terapia de luz roja infrarroja cercana. Antes de realizar la ronda final de tratamiento con luz, prepare los reactivos que se utilizarán para la detección de especies reactivas de oxígeno como indicador de estrés oxidativo. Aquí utilizamos dietas indicadas que emiten fluorescencia cuando reaccionan con una variedad de especies reactivas, incluida la dilución, el acetato de fluoresceína D, administramos un tratamiento de luz a las células como se describe en el paso cuatro, nos aseguramos de que las células estén siendo tratadas con las gripes y las longitudes de onda de luz deseadas.

Inmediatamente después del tratamiento con luz, retire el medio que contiene glutamato y lávese dos veces con PBS. Proceda con los ensayos utilizando tintes indicadores que emiten fluorescencia cuando reaccionan con especies reactivas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mida la fluorescencia generada por los tintes indicadores utilizando un lector de placas ajustado a los ajustes de excitación y emisión adecuados.

Utilice el color del kit métrico para cuantificar la concentración de proteínas en los pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Exprima las salidas de fluorescencia en relación con la concentración de proteínas de cada pocillo individual y, a continuación, analice los resultados mediante software estadístico. El desarrollo de esta técnica allana el camino para los investigadores que investigan los efectos de múltiples longitudes de onda e intensidades de la terapia de luz roja del infrarrojo cercano sobre el estrés oxidativo.

Esta técnica se puede utilizar en una variedad de sistemas modelo, incluidas células disociadas o cultivos organotípicos.