Protocolo para o isolamento de hepatócitos humanos primários e Correspondente principais populações de células do fígado não-parenquimatosas

Este método pode ajudar a responder perguntas-chave na área de hepatologia e toxicologia e nos oferecer a oportunidade para o desenvolvimento de novos modelos in vitro de co-cultivo e de fígado engenharizado em tecidos. A vantagem desta nova técnica é isolar todas as populações celulares hepáticas do mesmo doador e do mesmo pequeno fragmento de tecido hepático. Para iniciar este procedimento, pese o tecido hepático recém-dissecado em condições estéreis e coloque a amostra de tecido hepático na cabine de fluxo laminar.

Em seguida, remova o sangue da superfície da amostra de tecido. A seguir, lave as cânulas utilizando a solução de perfusão 1X um. Use a cola para tecidos para fixar as olivas das cânulas nos vasos sanguíneos maiores.

Em seguida, teste a perfusão e verifique vazamentos nas cânulas. Posteriormente, feche todos os vasos sanguíneos que apresentem vazamento de solução de perfusão 1X clara utilizando cola tecidual. Depois disso, coloque a amostra de tecido hepático cânulado no funil de Buchner.

Em seguida, ajuste a taxa de fluxo da bomba peristáltica entre 7,5 e 14,6 mililitros por minuto, dependendo do número de cânulas utilizadas e da resistência do tecido hepático. Perfunda o tecido até que todo o sangue seja removido, por pelo menos 20 minutos e no máximo 30 minutos. Em alguns casos, pode ser necessário prender uma das cânulas com grampos de plástico ou aumentar a pressão interna de uma região pressionando suavemente a cápsula hepática com uma espátula, a fim de otimizar a perfusão.

Uma mudança completa de cor, de vermelho acastanhado para marrom claro ou amarelo claro, indica uma boa perfusão. Em seguida, troque o fluido de perfusão pela solução digestiva contendo colagenase P. Depois, reorganize a montagem para a etapa de digestão. Posteriormente, realize um fluxo circular da solução digestiva por até 15 minutos.

Interrompa periodicamente a perfusão e verifique o grau de digestão. É essencial interromper imediatamente a perfusão com a solução de digestão quando a amostra de tecido hepático estiver suficientemente digerida. Retire o fígado do dispositivo quando estiver pronto e coloque-o em uma cuba de vidro.

Lave a parte externa da amostra de tecido com Solução de Parada gelada. Remova as cânulas da amostra de tecido hepático. Em seguida, use um bisturi para abrir a amostra de tecido hepático, fazendo um corte na região central onde as cânulas foram fixadas, certificando-se de que a cápsula de Glisson permaneça intacta.

Enxágue o interior da amostra tecidual e, em seguida, cubra toda a amostra tecidual com a Solução Paradora. Em seguida, agite suavemente o tecido para liberar as células. Depois, colete a suspensão celular e filtre-a através de um funil com gaze em 10 tubos plásticos de 50 mililitros.

Adicione mais Solução de Parada à amostra de tecido hepático até que um volume final de 500 mililitros seja atingido. Em seguida, centrifugue a suspensão celular, colete o sobrenadante para o isolamento de NPC posteriormente e reúna os pellets celulares em tubos plásticos de 250 mililitros. Posteriormente, lave os pellets celulares com PBS.

Para isso, centrifugue a suspensão celular. Colete o sobrenadante, reúna os pellets e re-suspenda o pellet em meio de incubação de hepatócitos. Em seguida, determine o número de células e a viabilidade na suspensão celular resultante utilizando coloração com azul de tripano.

Para isolar as células hepáticas não parenquimatosas, centrifugue o sobrenadante coletado para eliminar os eritrócitos e hepatócitos remanescentes. Colete os sobrenadantes e centrifugue-os duas vezes para obter os pellets celulares destinados à sedimentação de HCS, LEC, parte de KC e o restante de KC. Em seguida, re-suspenda os pellets em HBSS. Então, prepare um gradiente de densidade de 25% e um de 50% misturando a solução de gradiente de densidade e PBS para a centrifugação em gradiente de densidade.

Coloque cuidadosamente a solução de gradiente de densidade a 25% sobre a camada de solução de gradiente de densidade a 50%. Em seguida, adicione cuidadosa e lentamente a suspensão de NPC sobre a camada de solução de gradiente de densidade a 25% para obter uma separação nítida entre as duas camadas. Centrifugue a suspensão celular no gradiente de densidade sem interrupção.

Os NPC estão localizados na interfase entre as camadas do gradiente de densidade de 25% e 50%. Aspire as células mortas e os detritos celulares da camada mais superior e colete cuidadosamente a interfase. Após dupla centrifugação, realize uma contagem celular para a fração de KC e a fração de MPC.

Em seguida, centrifugue a fração de PCN com o passo de dupla centrifugação previamente descrito e re-suspenda o PCN no meio de semeadura de células de Kupffer. Semee a fração contendo CK em recipientes plásticos para cultura celular numa densidade de cinco vezes 10 à 5ª CK por centímetro quadrado. Incube as culturas de CK por 20 minutos em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Os KC primários devem aderir aos plásticos de cultura celular em um curto período de tempo. Em seguida, colete o sobrenadante contendo as NPC não aderidas, constituídas principalmente por LEC e HSC. Para separar LEC de HSC, inicie com uma centrifugação do sobrenadante.

Em seguida, lave o pellet com PBS. Após a segunda centrifugação, re-suspenda as células em meio de separação de células estreladas e células endoteliais e realize uma contagem celular para todas as células restantes. A seguir, re-suspenda 10 milhões de células em um mililitro de meio de separação de células estreladas e células endoteliais.

Em seguida, adicione 20 microlitros da solução bloqueadora do kit MAX e 20 microlitros das microesferas CD31 para imunomarcação e incube a suspensão resultante por 15 minutos à temperatura de quatro graus Celsius. Posteriormente, separe as LEC das HSC conforme descrito no protocolo do fabricante para o sistema de separação celular ativado magneticamente max e colete a fração de HSC. Elua as LEC positivas para CD31 retidas magneticamente e suspenda-as em meio de cultura de células endoteliais de células estreladas.

Aqui, essas imagens mostram as diferentes populações de células hepáticas isoladas diretamente após o processo de isolamento, na visão de microscopia de contraste de fase. Este conjunto de imagens apresenta as células isoladas e cultivadas após 24 horas de cultivo. A caracterização baseada em imunofluorescência de diferentes frações celulares é mostrada aqui.

Hepatócitos humanos primários (PHH) mostraram sinais positivos para o marcador de hepatócito CK18 24 horas após o isolamento, células de Kupffer (KC) foram positivas para o marcador CD68 24 horas após o isolamento, células endoteliais sinusoidais (LEC) mostraram sinais positivos para vimentina 72 horas após o isolamento, e células estreladas hepáticas (HSC) foram positivas para GFAP 72 horas após o isolamento. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que um isolamento bem-sucedido depende da digestão ideal da amostra de tecido hepático. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como controlar a digestão e como realizar a separação por gradiente de densidade, que são as etapas críticas deste procedimento.

Após seu desenvolvimento, esta técnica abriu caminho para pesquisadores na área de pesquisa médica explorarem funções hepáticas e doenças em culturas celulares in vitro recém-criadas e em modelos de fígado com tecido engenharizado.