Isolamento e cultura primária de células hepáticas de ratos

O objetivo geral deste procedimento é demonstrar um protocolo confiável para gerar hepatócitos viáveis em grande número. Isso é feito pela primeira perfusão da solução de colagenase através da veia porta do rato. Em seguida, as células dissociadas são isoladas e purificadas usando filtro de náilon de malha, e as células mortas são separadas das células viáveis usando solução por chamada.

A etapa final é cultivar os hepatócitos em uma incubadora. Em última análise, este protocolo gera até 100 milhões de células por preparação com 90% de viabilidade celular. A demonstração visual deste método é fundamental porque este procedimento requer etapas cirúrgicas e culturais que podem ser melhor compreendidas por vídeo do que por texto demonstrando que o procedimento será desmentindo um técnico do meu laboratório, As várias perfusões necessárias, tampões e meio completo de Williams devem ser preparados com um dia de antecedência usando técnica estéril antes de seu uso.

O tampão deve ser aquecido por 30 minutos em banho-maria a 42 graus Celsius. Isso corresponde a uma temperatura ideal de saída na cânula de 37 graus Celsius. O sistema de perfusão consiste na bomba autoclavável, tubulação elástica cy e um banho-maria predefine a vazão da bomba de perfusão peristáltica para 10 mililitros por minuto.

Em seguida, anestesiar um rato adulto com uma injeção intraperitoneal de cetamina e xilazina. Quando o rato não responder mais a um beliscão de dor, raspe os pelos abdominais e limpe a área cirúrgica com Betadine e etanol. Entre por uma incisão na linha média e exponha a veia porta hepática.

Mova cuidadosamente as vísceras para a direita fora da cavidade abdominal e insira um angiocateterismo de calibre 18 na veia porta hepática. Conecte o tubo PERFUSE oito à agulha e inicie a infusão em C dois a uma taxa de fluxo baixa com tampão de perfusão pré-aquecido um. Se executado corretamente, o fígado deve começar a branquear instantaneamente.

Assim que uma canulação bem-sucedida for confirmada, abra o AVC da veia inferior para permitir flx. Outro teste para uma canulação bem-sucedida é aplicar uma leve pressão na VCI. Usando um cotonete, todos os lobos do fígado devem começar a inchar rapidamente.

Em seguida, aumente o fluxo do buffer para 25 mililitros por minuto. O fígado deve ficar pálido. Quando o fígado ficar pálido, troque a solução de perfusão para tampão dois com colagenase dois por seis minutos de digestão, cinco a 10 vezes durante a digestão, aplique pressão na VCI com um cotonete por cinco segundos.

O fígado inchará levando a uma dissociação aumentada das células hepáticas. Por sua vez, reduzindo o tempo total de digestão e aumentando o rendimento final. Após a perfusão da colagenase, o fígado deve começar a parecer mole.

Dissecar o fígado livre. Coloque-o em um béquer estéril pré-resfriado com 40 mililitros de meio e transfira-o para uma capa de cultura de células de tecido para isolamento de células na capa de cultura de células. Transfira o fígado para uma placa de Petri com 20 mililitros de meio completo de Williams e use um raspador de células para dispersar suavemente as células do fígado para remover tecidos conjuntivos e fragmentos de tecido não digeridos.

Filtre a dispersão celular através de um filtro de células de tamanho de poro de 100 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, suspenda as células em 40 mililitros de centrífuga média. A suspensão a 50 vezes G por três minutos a quatro graus Celsius.

Aspire o sup, natin e ressuspenda suavemente as células. Em 40 mililitros de meio frio para lavar as células, centrifugue as células, novamente, aspire o snat e ressuspenda suavemente as células. Com 25 mililitros de meio pastilha as células e aspirar as células mortas Do topo do gradiente de perol, as células viáveis permanecem na parte inferior.

Suspenda o pellet de célula viável em 30 mililitros de meio quente e repita a centrifugação. Ressuspenda o pellet em 20 mililitros de meio. Conte as células dentro da suspensão usando um hemocitômetro e determine a viabilidade da célula.

Usando a coloração com azul triano, dilua os hepatócitos em Warm Williams, complete o meio até a concentração preferida e deposite-os em placas de cultura não revestidas no volume desejado. Uma preparação típica tem mais de 85% de células viáveis ou uma densidade de células plaqueadas de 60 a 70% de confluência. Isso permite o contato celular com células, mantendo espaço suficiente para que os hepatócitos cresçam até seu tamanho total e produzam uma confluência final de 90 a 95% para cultivar uma monocamada uniforme de hepatócitos sem agregados celulares.

Na área central do poço, deixe as placas permanecerem em temperatura ambiente por 30 minutos antes da incubação. Às vezes, quando você vê as células se agregando na área central da baleia, isso pode ser superado deixando a placa no capuz cultural por 30 minutos antes de entrar na incubadora. Isso garante que as células cresçam em sua camada mono uniforme.

Após quatro horas de incubação, o meio pode ser substituído por meio livre de soro para manter a morfologia celular sem efeitos adversos dos hormônios, permitindo que as células se recuperem e cresçam pelo menos durante a noite antes da experimentação. Enzimas críticas como P quatro 50 ainda estarão funcionais dentro de 24 horas, mas não muito mais. Substitua o meio de crescimento a cada dois dias, se necessário.

Após quatro horas em cultura, os hepatócitos agregam e agrupam a maioria das células isoladas, achatam e se espalham no crescimento típico da monocamada. Em 24 horas, as células se espalham em crescimento típico de monocamada. Suas bordas são definidas, suas junções são lineares, suas superfícies são bastante lisas e as gotículas lipídicas são visíveis.

As células têm de um a três nucléolos, que são redondos localizados no centro das células, e os núcleos exibem tamanho consistente entre as células. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar hepato viável em grande número em vermelho.