Ana Hücreleri ile Anaerobik Bakteriler Etkileşim değerlendirilmesi için bir model organizma olarak Porphyromonas gingivalis

Bu videonun genel amacı, anaerobik bakterilerin konakçı hücrelerle etkileşimini değerlendirmek için protokolleri göstermektir. Ary hücreleri yetiştirmek için kullanılan koşullar anaerobik bakteriler için toksiktir ve bunun tersi de geçerlidir. Bu, etkileşimlerinin incelenmesinde bir zorluk teşkil eder ve çalışma süresi boyunca metabolik olarak aktif kalmaları için her ikisi için de en uygun koşulların elde edilmesi gerekir.

Bu tür koşullar, in vivo olarak bulunan konak patojen etkileşimi senaryosunu daha doğru bir şekilde yansıtacaktır. Burada sunulan yöntem, mikrobiyal sağkalımda rol oynayan mekanizmaların yanı sıra enfeksiyon sırasında anaerobik bakteri hücrelerinin bağlanması ve içselleştirilmesi ile ilgili soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler mücadele edecektir çünkü anaerobik bakterilerle çalışmak anaerobik bir oda bilgisi ve iyi septik teknikler gerektirir.

Anaerobik bir odanın kullanımını içeren adımların öğrenilmesi zor olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Ayrıca, anaerobik odalarla deney yaparken dikkatli olunmalıdır Por uğursuz diş etleri ile kültür ve deneyler için. Bir vinil anaerobik oda, anaerobik odanın içine 30 kan agar plakası, 500 mililitre PBS ve 30 mililitre vasküler endotelyal büyüme faktörü veya VEGF ortamı yerleştirerek% 80 azot,% 10 hidrojen ve% 10 karbondioksit içeren yapay bir atmosfer ile korunur.

Reaktifleri dengelemek için 24 saat önce, tohumları dört kez 10 ila beş insan göbek veni endotel hücresine veya VE'ye, VEGF ortamındaki altı kuyucuklu plakada ve bunları bağlanma için gece boyunca hücre kültürü inkübatöründe bırakın. Ekteki metinde tarif edildiği gibi beyin kalp infüzyonunda veya BHI ortamında porro gingis kültürlerini hazırlayın ve kültürün 660 nanometredeki optik yoğunluğu 0,5 ila 0,7 arasında değişirken kültürlerin log fazına ulaşmasına izin verin. Bakterileri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve aerobik kapanmayı önlemek için kapağın etrafına bir parça paraform sarın.

Daha sonra bakterileri anaerobik oda içinde 10 dakika boyunca 5.000 kez G'de santrifüjleyin. Peletlenmiş bakterileri anaerobik PBS ile yıkayın ve 10 dakika boyunca 5.000 kez G'de tekrar döndürün. Reese, HU X'i uğursuz transfer ile enfekte etmek için VEGF ortamındaki bakterilere sahiptir.

İnkübatörden anaerobik odaya giden altı kuyucuklu plaka, ortamı test kuyularından aspire eder ve anaerobik PBS ile üç kez yıkayın Trian mavisi dışlama testi ile bir temsili kuyudan hücre sayısını belirleyin. Daha sonra anaerobik VEGF ortamının oyuğu başına iki mililitre ekleyin ve plakaları anaerobik inkübatörde 20 dakika boyunca 37 santigrat dereceye yerleştirin. Dengelemek için, bakterilerin ve resüslerin optik yoğunluğunu belirleyin.

100 ila bir bakteri hücre oranında çok sayıda enfeksiyonda hücreleri enfekte etmek için bunları yeterli miktarda VEGF ortamında askıya alın. Bakteriyel süspansiyonu hücrelere ekleyin ve anaerobik oda içinde hücre lizisi için enfeksiyon için 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. BHI ortamında hacim başına ağırlık% 1'lik bir saponin çözeltisi hazırlayın ve konakçı hücrelerle bakteriyel etkileşimleri incelemek için 0.2 mikronluk bir filtreden süzün.

Altı oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın ve enfeksiyon ortamını aspire edin. Anaerobik PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra her bir oyuğa iki mililitre saponin çözeltisi ekleyin ve hücre lizizine izin vermek için 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra, hücreleri kuyu dibinden kazıyın ve hücre lizatını BHI ortamı ile bire bir seyreltin. Daha sonra bir ila 100 arasında başlayan seri seyreltmeler yapın, kan agar plakaları üzerine 200 mikrolitre uygun bir seyreltme yapın. Plakaları perfil ile sarın ve koloni oluşumuna izin vermek için yedi gün boyunca 37 santigrat derece anaerobik inkübatörde inkübe edin.

Daha sonra bir ışık kutusu kullanarak, HU E hücrelerinin enfeksiyonunu takiben her plakadaki koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları sayın. Hücreleri anaerobik PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, HU E hücrelerine önceden optimize edilmiş antibiyotik konsantrasyonları ile takviye edilmiş iki mililitre VEGF ortamı ekleyin.

Hücreleri bir saat inkübe edin, ortamı aspire edin ve her bir kuyucuğa 15 dakika inkübe etmek için BHI içinde iki mililitre% 1 saponin çözeltisi ekleyin. Daha sonra, parçalanmış hücreleri kazıyın ve lizatı bir santrifüj tüpünde toplayın. Lizatı BHI ortamı ile bire bir seyreltin ve ardından birden 100'e kadar seri seyreltmeler hazırlayın.

Plaka 200 mikrolitre kan üzerinde uygun konsantrasyonlarda. Agar plakaları. Bakterilerin anaerobik bir odada yedi gün boyunca büyümesine izin verin ve ardından kolonileri sayın.

Açıklanan kaplama yöntemi, yalnızca hücrelerle etkileşime giren canlı bakterileri açıklar. Bu dezavantajın üstesinden gelmek için, içselleştirilmiş bakterileri görselleştirmek için hücre birlikteliğindeki hem canlı hem de ölü bakterilerin görselleştirilebildiği mikroskopi kullanıyoruz. İlk olarak, otoklavı aseptik olarak aktarın.

Cam kapak, 12 oyuklu bir plaka plakasının her bir oyuğunun içine, kapakta kuyucuk başına beş kez 10 ila dört kez kayar. Bakterileri, santrifüjü, midlock'u, faz bakterilerini etiketlemek için 24 saat boyunca kaydırın ve inkübe edin ve peleti anaerobik PBS santrifüjü ile tekrar süspanse edin ve yıkama adımını tekrarlayın. İki mililitre anaerobik PBS'ye 20 mikrolitre 0.2 milimolar B-C-E-C-F-A-M ekleyin, beş ila yedi çarpı 10 ila sekizinci içerir.

Mililitre başına bakteriler karanlıkta 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe eder. Kullandığımız floresan boya çoğu anaerobik bakteriyi lekeleyebilir, bu nedenle spesifik bir antikor gibi başka reaktiflere gerek yoktur. Bağlanmamış etiketleme reaktifini çıkarmak ve bakterileri VEGF ortamında yeniden süspanse etmek için bakteri süspansiyonunu 10 dakika boyunca 5.000 kez G'de santrifüjleyin.

Daha sonra UIC hücrelerini hücrelere 100 bakteri oranında enfekte edin ve 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, enfeksiyon ortamını çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra% 4 paraldehit ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.

Hücreleri anaerobik odaya sabitlemek için, sabit hücreleri odadan çıkarın ve ardından kapak fişlerini PB S3 ile yıkayın3 kez Kapak fişlerini hücrelere nüfuz etmek için 10 dakika boyunca bir mililitre% 0.2 tritton X 100 içinde inkübe edin. Daha sonra kapak fişlerini şimdi PB S3 ile yıkayın. Her bir kapağa mililitre başına 50 mikrolitre 50 mikrogram T-R-I-T-C foid ekleyin, kaydırın ve hücresel oligomerik aktini lekelemek için oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, kapak fişini PB S3 ile defalarca yıkayın. Nükleer boyama için zarif mililitrede bir mikrogram içeren yumuşak ayarlı montaj ortamı ile bir cam slayt üzerindeki kapak kızağını ters çevirin. Daha sonra kapak kaymasının çevresini oje ile kapatın ve anaerobik bakterinin konfokal mikroskopi etkileşimi altında gözlemleyin.

Bu sonuçlarda uve ile gözenekli diş etleri gösterilmiştir. Hücrenin, lizat içeren hücrenin bağlı veya içselleştirilmiş bakterilerin 100 kata seri seyreltilmesi, kan agar plakalarında sayılabilir sayıda CFU verdi. İnkübasyondan yedi gün sonra, vahşi tip porus vallis W 83 enfeksiyonu ile delesyon mutant V 315 enfeksiyonları arasındaki agar plakaları üzerindeki CFU veriminin karşılaştırılması burada gösterilmiştir.

Mutasyon, bakterinin enfekte olma yeteneğini etkiler. Burada gösterilen VE, enfekte olmuş hücrelerden elde edilen bakteri kolonilerinin grafiksel bir temsilidir. Etkileşim değerlendirildiğinde, vahşi tip suşa kıyasla enfekte olmuş hücrelerden daha az mutant bakteri geri kazanıldı.

Hücre dışı bakteri antibiyotik tedavisi ile öldürüldükten sonra elde edilen sonuçlar sağ sütunlarda gösterilmiştir. Yine, mutant suş, uve hücrelerini canlı olarak istila etmede yetersizdi. BCE CFAM ile etiketlendikten sonra bakteriler gözlenir.

Aktin filamentlerinin ve hücresel çekirdeğin ek boyanması sırasıyla kırmızı ve mavi floresan olarak görülebilir. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu tekniklerin her biri uygun şekilde uygulanırsa altı saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü denerken, bakterileri anaerobik koşullar altında tutmanın yanı sıra, deneyden önce 24 saate kadar anaerobik odadaki tüm ortam ve malzemeleri eşitlemeyi unutmamak önemlidir.

Anaerobik patojenlerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken eldiven giymek, el yıkamak ve septik teknikler kullanmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın. Dolayısıyla bu yöntem predental patojenler hakkında bilgi sağlayabilir. Aspirasyon, pnömoni, karın içi enfeksiyonlar, jinekolojik enfeksiyonlar ve insan vücudunun çeşitli bölgelerinde bulunan daha birçok anaerobik enfeksiyon gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Bu tekniğin etkileri, çeşitli anaerobik patojenler için ilaç tedavimize kadar uzanır, çünkü inhibitör önlemler protokole kolayca eklenebilir ve tedaviden sonra doğrudan içselleştirme ölçülebilir. Bu videoyu izledikten sonra, anaerobik bakterilerin nasıl kültürleneceğini iyi anlamalı ve konakçı hücrelerle etkileşime girme yeteneklerini değerlendirmelisiniz.