Radiomarquage et la quantification des niveaux cellulaires de phosphoinositides par chromatographie liquide haute performance couplée flux scintillation

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la quantité de chaque espèce de phosphoinositide dans les cellules dans diverses conditions génétiques et environnementales afin de comprendre la fonction et la régulation du phosphoinositide. Les lipides de phosphoinositide contrôlent les fonctions cellulaires telles que la migration, la réplication et le trafic de mémoire. Cette méthode identifie les conditions génétiques et environnementales qui ont un impact sur les phosphoinositides et augmente nos connaissances sur leur régulation et leur fonction.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une mesure précise et simultanée de tous les phosphoinositides à l’intérieur des cellules. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de la régulation des phosphoinositides chez les levures, elle peut également être appliquée à des cellules de mammifères en culture. Les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal à en raison des nombreuses étapes requises pour l’étiquetage, le traitement et l’analyse.

Nous vous recommandons de pratiquer d’abord sans le marqueur radioactif. Pour commencer, cultivez une culture liquide de 20 millilitres de la souche de levure SEY6210, dans un milieu synthétique complet à 30 degrés Celsius avec agitation constante jusqu’à la phase mi-logarithmique. Ensuite, transférez un total de 10 à 14 OD de cellules de levure dans un tube à centrifuger à fond rond de 12 millilitres et centrifugez à 800 fois G pendant cinq minutes.

Décantez le support. Et remettez la pastille en suspension dans 2 millilitres de milieu sans inositol. Centrifugez à nouveau les cellules.

Et puis remettez en suspension la pastille dans 440 microlitres de milieu sans inositol. Incuber les cellules à température ambiante pendant 15 minutes. Après l’incubation, ajoutez 60 microlitres de myo-inositol marqué au tritium et cultivez les cellules pendant une à trois heures supplémentaires à 30 degrés Celsius en secouant constamment.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation contenant 500 microlitres d’acide perchlorique à 9 % et 200 microlitres de billes de verre lavées à l’acide. Mélangez en inversant le tube à plusieurs reprises, puis incubez sur de la glace pendant cinq minutes. Ensuite, faites tourbillonner le tube à vitesse maximale pendant 10 minutes.

Transférez ensuite le lysat dans un nouveau tube de microcentrifugation à l’aide d’un embout de chargement de gel pour éviter d’aspirer les billes de verre. Ensuite, centrifugez le tube et jetez le surnageant. Sonicez la pastille dans un millilitre d’EDTA 100 millimolaires glacé jusqu’à ce qu’elle soit complètement dispersée, puis centrifugez-la à nouveau.

Après la centrifugation, aspirez l’EDTA du tube contenant la pastille radiomarquée. Ajoutez 50 microlitres d’eau et de sonicate pour remettre la pastille en suspension. Préparez le réactif de désacylation frais selon le protocole textuel.

Ajoutez ensuite 500 microlitres de réactif de désacylation dans le tube et soniquez pour mélanger. Incuber l’échantillon à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, transférez l’échantillon dans un bloc chauffant à 53 degrés Celsius pendant 50 minutes.

Ensuite, placez l’échantillon dans une centrifugeuse sous vide et laissez-le sécher pendant au moins trois heures. Remettez la pastille en suspension en la trempant dans 300 microlitres d’eau, et incubez-la à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, séchez complètement l’échantillon dans une centrifugeuse à vide pendant au moins trois heures.

Après séchage, ajoutez 450 microlitres d’eau dans le tube et remettez le granulé en suspension en le sonifiant jusqu’à ce qu’il soit complètement dispersé. Préparez le réactif d’extraction frais selon le protocole de texte. Ajoutez 300 microlitres de réactif d’extraction et vortex à vitesse maximale pendant cinq minutes.

Centrifugez le tube à 18000 fois G pendant deux minutes et pipetez soigneusement la couche aqueuse inférieure dans un nouveau tube. Ensuite, séchez la fraction aqueuse finale par centrifugation sous vide pendant au moins trois heures. Ensuite, dispersez complètement la pastille en la sioniant dans 50 microlitres d’eau et conservez l’échantillon à 20 degrés Celsius.

Enfin, déterminez la radioactivité de l’échantillon en ajoutant deux microlitres à quatre millilitres de liquide de scintillation dans un flacon à scintillation en polyéthylène de 6 millilitres. Enregistrez le CPM du flacon à l’aide d’un compteur à scintillation liquide avec une fenêtre ouverte. Pour mettre en place le système HPLC pour la séparation des glycéro-inositides marqués au tritium, préparez d’abord les tampons A et B, ainsi que la colonne de chromatographie conformément au protocole de texte.

Ensuite, chargez 10 millions de CPM de l’échantillon dans un flacon d’injection de deux millilitres, équipé d’un insert à ressort de 250 microlitres, et ajoutez de l’eau pour un volume total de 55 microlitres. Boucher le flacon à l’aide d’un bouchon à vis équipé d’un septum en silicone PTFE et le placer dans le plateau d’échantillonnage automatique du système HPLC, avec une ébauche d’eau dans un flacon similaire. À l’aide du logiciel du système HPLC, programmez un protocole d’élution.

Un pour cent de tampon B pendant cinq minutes, un à 20 pour cent B pendant quarante minutes, 20 à 100 pour cent B pendant dix minutes, 100 pour cent B pendant cinq minutes, 100 pour cent B pendant vingt minutes, puis un pour cent B pendant dix minutes. Réglez le débit de la pompe à 1,0 millilitre par minute pendant 90 minutes et la limite de pression à 400 bars. Ensuite, mettez en place un protocole de détection sur le scintillateur d’écoulement pour qu’il fonctionne pendant 60 minutes, avec un débit de fluide à scintillation de 2,5 par minute et un temps de séjour de 8,57 secondes.

Ensuite, programmez une séquence d’injection automatisée sur la HPLC pour commencer avec l’ébauche d’eau exécutant le protocole d’équilibration, suivie de l’échantillon radiomarqué sur le protocole d’élution. Avant que le protocole d’équilibrage ne soit terminé, créez une séquence de lots sur le scintillateur à flux pour mesurer tous les échantillons à l’aide du protocole de détection, qui est déclenché par le protocole d’élution. Pour analyser les données HPLC, ouvrez d’abord le fichier de données brutes de chaque échantillon, à l’aide du logiciel de quantification du chromatographe.

Dans l’onglet chromatogrammes, zoomez pour étirer les pics inférieurs tout en conservant la résolution temporelle. Utilisez l’outil d’ajout de retour sur investissement pour mettre en évidence chaque pic à analyser, puis identifiez les pics en fonction de leur temps d’élution. Utilisez l’onglet de la table des régions pour localiser et enregistrer la zone de chaque pic.

En même temps, notez l’heure de début et de fin de chaque pic. Ensuite, effectuez une soustraction d’arrière-plan pour chaque pic en mettant en surbrillance une région adjacente au pic, couvrant la même durée. À l’aide du tableur, soustrayez le nombre de comptages pour cette région des comptages du pic correspondant.

Normalisez l’aire de chaque pic par rapport au pic d’inositol glycéré parental, et enregistrez en pourcentage du phosphatidylinositol parental. Ensuite, normalisez chacun des pics dans chaque condition expérimentale par rapport à la condition de contrôle, et exprimez comme l’augmentation du pli final par rapport au contrôle. Exportez les fichiers en cliquant sur Fichier, puis sur Enregistrer sous, puis en choisissant le format CSV.

Enfin, ouvrez le fichier CSV dans un tableur pour tracer les données. L’analyse des phosphoinositides de levure radiomarqués a été réalisée par HPLC. Étant donné que les cellules de levure ne génèrent que quatre phosphoinositides, la résolution peut être obtenue avec une méthode d’élution à double gradient d’une heure.

Le pic d’inositol glycéré faisant allusion à huit à neuf minutes a éclipsé le signal de toutes les autres espèces phosphorylées. Il est donc nécessaire de zoomer sur la partie de la trace contenant les autres pics avant d’intégrer les signaux radioactifs. Des souches de levure de type sauvage, supprimées d’ATG18 et de VAC14 ont été analysées pour détecter des changements dans le phosphatidylinositol 3,5-bisphosphate à l’aide de cette méthode HPLC.

Il a été démontré que le mutant supprimé ATG18 produisait le plus de phosphatidylinositol 3, 5-bisphosphate et que le mutant supprimé VAC14 en produisait le moins. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre jours si elle est bien faite. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’optimiser les conditions de croissance et de marquage en fonction de la souche de levure spécifique ou des types de cellules.

À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, telles que les biocapteurs fusionnés à la GFP, peuvent être utilisées pour compléter la scintillation de flux HPLC pour la détection des phosphoinositides. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de radiomarquer, d’extraire et de mesurer les phosphoinositides par scintillation à flux couplé HPLC. N’oubliez pas que travailler avec de la radioactivité et des solvants organiques peut être extrêmement dangereux, et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle et une formation appropriée doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.