İfade ve Aşılama için Virüs benzeri Parçacıkların saflaştırılması

Bu prosedürün genel amacı, memeli veya böcek hücresi ekspresyon sistemleri tarafından ifade edilen ve salgılanan virüs benzeri parçacıkları veya VLP'leri saflaştırmaktır. Bu yöntem, konformasyonel olarak ilgili viral antijenlerin güvenli ve esnek bir şekilde nasıl ifade edileceği ve saflaştırılacağı gibi bir aşı alanındaki temel soruları yanıtlayabilir. Bu tekniğin ana avantajı, VLP'leri konsantre etmek için polietilen glikol kullanılarak protein çökeltme veya çoklu yoğunluk katmanlarının hazırlanmasını gerektirmemesidir.

Bu yöntem, viral antijenlerin aşı hedefleri olarak tanımlanması hakkında bilgi sağlayabilse de, VLP'ler hastalık teşhisi ve serolojisi için araçlar olarak da kullanılabilir. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir, çünkü VLP resüspansiyonunda bir gliserol altlığı adımlarının öğrenilmesi zordur, çünkü yeni başlayanlar uygun tekniği uygulayamayabilir. Transveksiyon gününde, üreticinin tavsiyelerine göre lipozom ve DNA çözeltileri hazırlayın.

DNA hücrelerini, bir ila bir ila iki HA'dan NA'ya Gag'a ve T150 şişesi başına toplam 40 mikrogram DNA miktarına sahip bir DNA bileşimi ile transvect edin. Toplam 150 mililitre hacim için dokuz T200 şişesi oluşturmak için bu adımı tekrarlayın. Daha sonra, DNA ve lipozom çözeltilerini antibiyotik içermeyen serumsuz transveksiyon ortamında seyreltin, böylece her bir şişenin toplam hacmi 24 mililitre olur.

Şişeleri inkübatöre geri koyun ve hücreleri ve transveksiyon kültürü ortamını virüs benzeri bir parçacık veya VLP hasadı gününe kadar koruyun. Transveksiyondan 72 ila 96 saat sonra kültürü hücrelerden toplamak için süpernatanı 50 mililitrelik konik tüplere aktarın. Hücresel kalıntıları peletlemek için hücreleri aşağı doğru döndürün.

Süpernatanları toplayın ve 0.22 mikronluk bir membrandan süzün. Daha önce hazırlanmış spodoptera frugiperda veya Sf9 hücrelerinin, çok noktalı bir karıştırma plakası sistemi üzerinde 130 rpm'de sürekli karıştırılarak, eğirme şişelerinde süspansiyon halinde kültürlenmesi. Uygun havalandırma için kültür hacimlerini, eğirme şişesinin hacminin yarısından fazla olmayacak şekilde tutun.

Daha sonra, önceden hazırlanmış rekombinant bakulovirüs ile mililitre başına iki kez on ila altı hücre yoğunluğunda bir spinner şişesinde 250 mililitre Sf9 hücresini enfekte ederek CHIK VLP'leri eksprese edin ve hücreleri 28 derecelik bir Santigrat derece inkübatöre geri koyun. Hücre canlılığının %70 ila %80'e düşüp düşmediğini belirlemek için tripan mavisi dışlamasını kullanınOnaylandıktan sonra, kültürleri doğrudan süspansiyondan 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hücreleri aşağı doğru döndürün. Süpernatanları toplayın ve çökeltmeden önce 0.22 mikronluk bir dökme membrandan süzün.

Altı adet 25 milimetre x 89 milimetre üstü açık ultrasantrifüj tüpünü %70 etanol ile sterilize edin. Ardından, etanolün tamamen kuruduğundan emin olun. Temiz tüplere 32 mililitre süpernatan yükleyin.

Daha sonra, süpernatanları üç mililitre steril% 20 gliserol ve PBS ile dikkatlice yerleştirin. Gliserol ve VLP çözeltisi arasındaki ince yoğunluk tabakasının bozulmasını önlemek için gliserolü yavaşça altına alın. Gliserolün çok hızlı dağıtılması, gliserol ve VLP çözeltilerinin karışmasına neden olarak VLP sedimantasyonunu azaltır.

Tüplerin dengelendiğinden emin olun, ardından sıkmaya başlayın. Dört saat sonra tüpleri santrifüjden çıkarın. Süpernatanı aspire edin, peleti tüpten çıkarmamaya dikkat edin.

Sedimantasyonlu VLP'leri steril PBS ile tüplerin dibinde en az 100 mikrolitrede nazikçe ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. VLP peletinin yeniden süspansiyonu, bir pipet kullanılarak nazik, yavaş tekrarlanan aspirasyon ve PBS'nin atılması ile gerçekleştirilmelidir. VLP kaybını sınırlamak için baloncuk oluşturmaktan kaçının.

Son olarak, yeniden askıya alınan VLP'leri saklayın. Konvansiyonel bir BCA testinden elde edilen VLP hacimleri ve toplam protein verimi, çeşitli SVP ve VLP yapılarından elde edildi. Sf9 hücrelerinden elde edilen CHIK SVP verimleri, mililitre süpernatan hacmi başına 0.008 ila 0.016 miligram toplam protein arasında değişir.

Memeli 293 T hücresi yoluyla yapılan üretim, proteinde on kat azalma sağlar. Bu elektron mikrograf görüntüsü, HA Gag çekirdek influenza VLP'lerinin VLP'ler olarak başarılı bir şekilde eksprese edildiğini, birleştirildiğini ve saflaştırıldığını göstermektedir. Bu prosedürü denerken, genel protein ekspresyon seviyelerini etkileyeceğinden, yalnızca sağlıklı ve canlı hücre kültürlerini transvect etmeyi ve enfekte etmeyi hatırlamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, toplam protein içeriğini, spesifik antijen içeriğini ve fonksiyonel HA ekspresyonunu ölçmek için BCA, ELIZA ve HA tahlilleri gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bir ultrasantrifüj ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken tüplerin dengelenmesi, yalnızca önerilen rotorların ve hızların kullanılması ve yeni laboratuvar personelinin uygun şekilde denetlenmesi gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.