Böcek hücrelerinde bakulovirüs ekspresyon sistemi kullanılarak chikungunya virüsü benzeri parçacıkların üretilmesi

Chikungunya virüsü benzeri parçacıklar, VLP'ler, bir lipid çift tabakası içine gömülü viral zarf proteinlerinden oluşan ve genetik materyalden yoksun bulaşıcı olmayan yapılardır.

Chikungunya VLP'leri üretmek için, Spodoptera frugiperda Sf9 böcek hücrelerini bir Chikungunya yapısal gen kaseti eksprese eden rekombinant bakulovirüslerle enfekte edin. Kaset, kapsid kodlayan chikungunya yapısal genleri ve zarf proteinleri ile kaynaşmış bir bakulovirüs promotöründen oluşur.

İnkübasyon sırasında, bakulovirüs zarf glikoproteinleri böcek hücreleri üzerindeki yüzey reseptörlerine bağlanır. Bu, bakulovirüsün sitoplazmaya girişini ve viral DNA'nın salınmasını kolaylaştırır, chikungunya kapsid ve zarf proteinleri içeren poliproteinler üretir.

Sentez sonrası, kapsid proteininin otokatalitik bölünmesi, endoplazmik retikulum, ER'de zarf proteinlerine sahip öncü poliproteini üretir. ER lümeninde, enzimler öncü poliproteini parçalayarak, daha sonraki işlemler için Golgi bölmesine giren ve protein heterotrimerleri oluşturan bireysel proteinler üretir.

Golgi yerleşik proteazları, E2 ve E1 proteinleri ile olgun zarf proteinleri üreterek protein heterotrimerlerini parçalar. Bu zarf proteinleri zara yer değiştirir, VLP'lere tomurcuklanır ve ortama salınır.

Enfekte kültürü bir tüpe aktarın ve böcek hücrelerini peletlemek için santrifüjleyin. VLP içeren süpernatanı aspire edin ve kalıntıları gidermek için filtreleyin.

Chikungunya VLP'leri içeren elde edilen filtrat, immünopatoloji çalışmaları için hazırdır.

Daha önce hazırlanmış Spodoptera frugiperda veya Sf9 hücrelerini, çok noktalı bir karıştırma plakası sistemi üzerinde 130 rpm'de sürekli karıştırılarak eğirme şişelerinde süspansiyon halinde kültürleyin. Uygun havalandırma için kültür hacimlerini, eğirme şişesinin hacminin yarısından fazla olmayacak şekilde tutun. Daha sonra, önceden hazırlanmış rekombinant bakulovirüs ile mililitre başına 2 x 10⁶ hücre yoğunluğunda bir döner şişesinde 250 mililitre Sf9 hücresini enfekte ederek CHIK VLP'leri eksprese edin ve hücreleri 28 derecelik bir Santigrat derece inkübatöre geri koyun.

Hücre canlılığının %70 ila %80'e düşüp düşmediğini belirlemek için tripan mavisi dışlamasını kullanın. Onaylandıktan sonra, kültürleri doğrudan süspansiyondan 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve hücreleri aşağı doğru döndürün. Süpernatanları toplayın ve çökeltmeden önce 0.22 mikronluk bir gözenek zarından süzün.