Genetic Engineering eines Unconventional Hefe für Erneuerbare Biokraftstoff- und Biochemie Produktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die Entwicklung effektiver gentechnischer Methoden für eine unkonventionelle Hefeart, einschließlich der Konstruktion transformierender DNA, der DNA-Transformation, der Transformantenauswahl und der gezielten Gendeletion durch homologe Rekombination. Wir haben eine hochgradig visionäre Gendeletionstechnik im PO1G-Stamm von Yarrowia lipolytica etabliert, die potenzielle Anwendungen in der Produktion von Biokraftstoffen und Biochemikalien bietet. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der PCR-vermittelten Gendisruption besteht darin, dass große Mengen an Gendeletionssicheln und die breite Palette an selektierbaren Markern zur Verfügung stehen.

In dieser Studie berichten wir über das genetische Transformationsprotokoll für den Stamm Yarrowia lipolytica PO1G, das effizient, einfach, renommiert und reproduzierbar ist. Der in dieser Studie konstruierte Yarrowia lipolytica PO1G KU70-Deletionsstamm zeigt eine sehr effiziente homologe Rekombinationsfrequenz, die ein schnelleres und einfacheres Screening gezielter Gendeletionen ermöglicht. Der erste Schritt in diesem Verfahren besteht darin, die LEU2-Expressionskassette mittels PCR aus einem Y.lipolytica-Expressionsvektor zu amplifizieren und LoxP-Stellen in die 5-Prime- und 3-Prime-Enden der LEU2-Kassette einzuführen.

Eine BamHI-Restriktionsstelle wird auch in Primer eins für nachfolgende Schritte des Klonierungsprozesses eingeführt. Nach der Aufreinigung der LoxP-Promotor-LEU2-Terminator-LoxP-Kassette werden dem aufgereinigten PCR-Produkt drei Prime-A-Überhänge hinzugefügt. Das A-tailed PCR-Produkt wird dann in einen TA-Klonierungsvektor ligiert, um das Plasma-T-LEU2 zu erhalten.

Der zweite PCR-Schritt besteht darin, die eine Kilobase 5-Prime-Upstream-Sequenz des KU70-Gens unter Verwendung der Primer drei und vier aus der genomischen DNA von Y.lipolytica PO1G zu amplifizieren. Danach werden sowohl das gereinigte PCR-Produkt als auch das T-LEU2-Plasmid mit SacII- und BamHI-Enzymen doppelt verdaut und das gereinigte und verdaute PCR-Produkt an die SacII-BamHI-Stellen von T-LEU2 ligiert, um das Plasmid T-LEU2-5E zu erhalten. Der dritte PCR-Schritt besteht darin, die eine Kilobase 3-prime-Downstream-Sequenz des KU70-Gens unter Verwendung der Primer fünf und sechs aus der genomischen DNA von Y.lipolytica PO1G zu amplifizieren.

Anschließend wird sowohl das gereinigte PCR-Produkt als auch das T-LEU2-53-Plasmid mit NotI- und NdeI-Enzymen doppelt verdaut und das gereinigte und verdaute PCR-Produkt an die NotI-NdeI-Stellen von T-LEU2-5E ligiert, um das T-KO-Plasmid zu erhalten. Verdauen Sie zuletzt das T-KO-Plasmid mit SacII- und NdeI-Enzymen, um die Störungskassette herzustellen. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Vorbereitung kompetenter Y.lipolytica PO1G-Zellen.

Eine Kolonie von Y.lipolytica PO1G-Stamm aus einer frischen Hefeextrakt-Pepton-Dextrose- oder YPD-Platte in 10 Millilitern YPD-Medium in einem 100-Milliliter-Kolben impfen. Inkubieren Sie in einem 30 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator bei 225 U/min für 20 Stunden bis zur Sättigung. Am nächsten Tag pelletieren Sie die Zellen, indem Sie fünf Minuten lang bei 5000 G bei Raumtemperatur cetrifugen

Waschen Sie die Zellen mit 20 Millilitern TE-Puffer und pelletieren Sie die Zellen erneut. Nach Entfernen des Überstands werden die Zellen in einem Milliliter 0,1 molare Lithiumacetate resuspendiert und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Teilen Sie die kompetenten Zellen in bis zu 100 Mikroliter Aliquote in sterile 1,5 Milliliter Röhrchen auf.

Fahren Sie sofort mit dem Transformationsverfahren fort, indem Sie 10 Mikroliter denaturierte Lachsspermien-DNA und ein bis fünf Mikrogramm der gereinigten Disruptionskassette vorsichtig mit 100 Mikrolitern kompetenter Zellen mischen. Inkubieren Sie 15 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Fügen Sie 700 Mikroliter 40% Polyethylenglykol für 1000 hinzu.

Gut mischen und in einem 30 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator bei 225 U/min 60 Minuten lang inkubieren. Als nächstes erhitzen Sie die Transformationsmischung, indem Sie das Rohr 60 Minuten lang in ein 39 Grad Celsius heißes Wasserbad legen. Geben Sie nach 60 Minuten einen Milliliter YPD-Medium in das Röhrchen und lassen Sie die Zellen zwei Stunden lang bei 30 Grad Celsius bei 225 U/min erholen.

Zentrifugieren Sie bei 9000 mal G für eine Minute bei Raumtemperatur. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einem Milliliter TE-Puffer. Zentrifugieren Sie die Zellen erneut und verwerfen Sie den Überstand.

Resuspendieren Sie das Pellet in 100 Mikrolitern TE-Puffer und legen Sie es auf eine Leucin-defiziente Platte. Inkubieren Sie die Platte zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius. Vor der Durchführung der CRE-Rekombinase-vermittelten Markerrettung wird das CRE-Expressionsplasmid wie im Textprotokoll beschrieben konstruiert.

Zu den Merkmalen dieses episomal replizierenden Plasmids gehören ein CRE-Rekombinase-Gen, ein Hygromycin-B-Resistenzmarker und ein Ampicillin-Resistenzgen. Um dieses Verfahren zu beginnen, transformieren Sie das CRE-Expressionsplasmid in kompetente Zellen des KU70-Knockout-Stammes gemäß dem zuvor gezeigten Transformationsprotokoll. Plattieren Sie die transformierten Zellen auf YPD- plus Hygromycin-B-Platten und inkubieren Sie sie zwei bis drei Tage lang bei 30 Grad Celsius.

Nach der Durchführung der Kolonie-PCR, wie im Textprotokoll beschrieben, zur Identifizierung positiver Kolonien, wählen Sie einen positiven Klon aus, um zwei Milliliter YPDH-Medium zu impfen, und inkubieren Sie in einem 30 Grad Celsius heißen Schüttelinkubator bei 225 U/min über Nacht bis zur Sättigung. Messen Sie am nächsten Tag den OD 600 der Kultur mit einem Spektralphotometer. Wenn sich die Zellen bei einem OD 600 von etwa 15 befinden, ernten Sie durch Zentrifugation bei 5000 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie den Überstand, fügen Sie zwei Milliliter steriles Wasser hinzu und schleudern Sie erneut. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in YPD-Medium. Reinokulieren Sie die Zellen in bis zu zwei Millilitern YPD-Medium mit einem anfänglichen OD 600 von 0,1. Und lassen Sie die Zellen in einem 30 Grad Celsius heißen Inkubator bei 225 U/min über Nacht wachsen.

Am nächsten Tag die Zellkultur über Nacht auf YPD-Platten streichen, um einzelne Kolonien zu isolieren. Inkubieren Sie bei 30 Grad Celsius, bis Kolonien entstehen. Replikationsplattenkolonien auf YPD-, YPDH- und Leucin-defizienten Platten.

Inkubieren Sie die Platten zwei Tage lang bei 30 Grad Celsius. Ein Schema des KU70-Knockout-Plasmids ist dargestellt. Der Verdau des Plasmids mit SacII- und NdeI-Enzymen erzeugt die Disruptionskassette.

Die Gelelektrophorese bestätigt das Vorhandensein einer 4,3-Kilobasen-Bande, was der erwarteten Größe der Störungskassette entspricht. Die KU70-Gendeletion in Y.lipolytica PO1G wird durch PCR bestätigt. Die Spuren eins bis 10 enthalten PCR-Produkte, die aus der genomischen DNA von Transformanten amplifiziert wurden, und Spur 11 enthält PCR-Produkte des Wildtyp-Stammes.

Bahn sieben zeigt einen positiven Knockout, während Bahn eins ein falsch positives Ergebnis zeigt. Das Selektionsmarkergen im KU70-Knockout-Stamm wurde schließlich durch die Expression von CRE-Rekombinase entfernt. Positive markerfreie Transformanten wurden durch ihr Wachstum nur auf einer YPD-Platte verifiziert.

Um den Anstieg der Gendeletionsrate zu verifizieren, wurden nach der Deletion des KU70-Gens 11 Zielgene einzeln mit dem gleichen Verfahren im KU70-Knockout-Stamm deletiert. Jede Genstörung wurde durch PCR bestätigt und hier wird ein repräsentatives Ergebnis gezeigt, wobei die Spuren eins, zwei und vier als positive Knockouts identifiziert wurden. Der Yarrowia lipolytica PO1G KU70 Deletions-Platinstamm bietet ein effizienteres System und eine bessere Wahl für Anwendungen im Bereich Pathway Engineering und Stammoptimierung bei der Konstruktion anderer chromosomaler Deletionsmutanten.

Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein umfassendes Verständnis der gezielten Einzelgen-Deletionsstrategie durch homologe Rekombination in den PO1G-Zellen von Yarrowia lipolytica haben.