-High Throughput, Multi-Image Cryohistology di mineralizzati tessuti

L'obiettivo di questa tecnologia è fornire strumenti istologici che integrino sistemi di modelli complessi in modo ad alta produttività, indipendente dall'osservatore e completamente digitale, che sia conveniente e significativo per i biologi muscoloscheletrici. L'estologia, sebbene fondamentale per la maggior parte dei ricercatori biologici, è spesso laboriosa e non quantitativa. Pertanto, sono necessarie tecniche istologiche che forniscano analisi efficienti, ad alta produttività e automatizzate.

Con la nostra piattaforma di crioistologia, il ricercatore può associare più segnali molecro a cellule specifiche all'interno di un determinato campione mediante imaging e colorazione dello stesso vetrino più volte in modo ad alto rendimento. A dimostrare la procedura saranno i Dott. Xi Jiang e Li Chen, assistenti di ricerca nel mio laboratorio, che hanno aperto la strada allo sviluppo e all'esecuzione di queste tecniche. Per iniziare questa procedura, rimuovere il campione dalla formalina, sezionare il tessuto in eccesso e trasferirlo al saccarosio al 30%, prodotto in 1x PBS.

Incubare i campioni in saccarosio per 12-24 ore a quattro gradi Celsius. Successivamente, riempire un criopoldo con un mezzo di crioinclusione e posizionare i campioni nello stampo. Quindi, allineare i campioni nello stampo in modo che il piano di taglio per la regione di interesse sia parallelo al fondo dello stampo.

Dopodiché, posiziona il criomold su un pezzo di ghiaccio secco fino a quando un sottile strato di mezzo di crioinclusione non si congela, bloccando gli spicimens in posizione. Quindi, riempire il volume rimanente del criomold con un mezzo di crioinclusione, mantenendo il criomold sul pellet di ghiaccio secco. Successivamente, mettere il criomold in un contenitore contenente 2-metilbutano pre-raffreddato con ghiaccio secco.

Una volta che i campioni sono completamente congelati, rimuovere il criomold e scrollarsi di dosso l'eccesso di 2-metilbutano. Avvolgi il criomold nel cellophane e conservalo a meno 20 gradi Celsius o meno 80 gradi Celsius. In questa procedura, trasferire il blocco di campioni dal congelatore a un criostato impostato a una temperatura compresa tra meno 20 e meno 25 gradi Celsius.

Quindi, rimuovi il blocco dal criopoldo e taglia via il mezzo di crioinclusione in eccesso con una lama di rasoio. Quindi, aggiungere un po' di mezzo di crioinclusione sul disco del campione e allineare il blocco in modo che la superficie del disco del campione sia parallela alla superficie inferiore del blocco. Attendere che il mezzo di crioinclusione si congeli.

Successivamente, posizionare il disco del campione sulla testa del campione e regolare la testa in modo che la lama tagli parallelamente alla superficie del blocco del campione. Quindi, tagliare pezzi di crionastro per coprire la regione di interesse e pre-raffreddarli nel criostato. Successivamente, riduci il blocco a un livello all'interno della regione di interesse, continuando ad apportare le modifiche necessarie.

Una volta raggiunta la regione di interesse e realizzata una sezione, spazzolare via eventuali trucioli dalla superficie del blocco. Quindi, rimuovere il supporto non aderente dal crionastro afferrando il nastro per le linguette d'argento oro non appiccicose. Quindi posizionare il nastro sul blocco con il lato adesivo rivolto verso il basso.

Applicare pressione al crionastro utilizzando il rullo e creare una sezione utilizzando il motore automatico o la rotella di taglio manuale del criostato. Successivamente, posizionare la sezione con il lato del tessuto rivolto verso l'alto su un vetrino da microscopio in plastica all'interno del criostato. Rimuovere il vetrino di plastica dal criostato e lasciare che il mezzo di crioinclusione si sciolga, in modo che la sezione aderisca alla superficie del vetrino.

Ripetere il sezionamento per le sezioni seriali o altre regioni di interesse. Una volta terminato, posizionare le sezioni in una scatola di vetrini e conservarle a quattro, meno 20 o meno 80 gradi Celsius, a seconda della durata dello stoccaggio richiesto e delle misure di risposta a valle. Per eseguire il metodo dell'adesivo polimerizzabile UV, etichettare prima il vetrino del microscopio.

Applicare una goccia di adesivo ottico attivato dai raggi UV su due vetrini e utilizzare il bordo di un vetrino per stendere un sottile strato di adesivo sulla superficie dei vetrini. Quindi, tagliare la linguetta d'argento oro e stendere la sezione nastrata con il fazzoletto rivolto verso l'alto, sullo strato adesivo del primo vetrino. Applicare la sezione con un movimento di rotolamento da un bordo all'altro per ridurre al minimo la formazione di bolle intrappolate sotto il nastro.

Successivamente, rimuovere la sezione nastrata dalla prima diapositiva, quindi posizionarla sullo strato adesivo della seconda diapositiva e fare attenzione a evitare l'intrappolamento di bolle. Una volta posizionato il numero appropriato di sezioni per l'esperimento in questione su ciascun vetrino, rimuovere l'adesivo in eccesso dalle aree circostanti. Quindi, ispeziona attentamente le sezioni per verificare la presenza di bolle o fibre sotto il nastro.

Quindi posizionare i vetrini del microscopio sotto la luce nera UV per cinque-dieci minuti per reticolare lo strato adesivo. In questa fase, preparare la soluzione del marcatore di riferimento sciogliendo 50 microlitri di microsfere verdi e 50 microlitri di microsfere rosse in 100 microlitri di acqua. Conservare la soluzione al buio a quattro gradi Celsius.

Quindi immergere il puntale di una pipetta nella soluzione di microsfere e tamponare la soluzione di microsfere su ciascuna sezione, adiacente alla regione di interesse. Successivamente, asciugare i vetrini a temperatura ambiente e proteggerli dalla luce coprendoli con un foglio di alluminio per 30 minuti, se si elaborano i vetrini in quel giorno. In caso contrario, posizionare i vetrini in una casella di diapositiva a quattro gradi Celsius.

Dopo aver colorato le sezioni, montare i vetrini coprioggetto sulle guide utilizzando un mezzo di montaggio acquiescente. Per eseguire l'imaging, caricare i vetrini nei vassoi del microscopio e inserire i vassoi nella pila di vassoi del microscopio a scansione di vetrini. Quindi, fare clic sull'elenco dei profili nel software del microscopio per caricare un profilo per ogni vetrino con il tempo di esposizione appropriato per ogni fluroforo.

Quindi, fare clic sul pulsante Avvia scansione anteprima per scattare un'immagine di anteprima di ogni diapositiva. Il software applicherà automaticamente un nome di file leggendo i codici a barre posizionati sulle etichette dei vetrini. In alternativa, è possibile assegnare manualmente un nome file a ciascuna diapositiva.

Impostare le regioni di interesse accedendo alla procedura guidata di rilevamento dei tessuti, disegnando ciascuna regione utilizzando lo strumento di disegno, apportando le modifiche necessarie e salvandole per i cicli successivi di imaging. Una volta configurata ogni diapositiva, avviare il processo di scansione facendo clic sul pulsante Avvia scansione. Dopo ogni ciclo di imaging, immergere i vetrini in un barattolo di coplin riempito con un PBS 1x fino a quando i vetrini coprioggetto non cadono dai vetrini, prima della successiva fase di colorazione.

Dopo aver completato tutti i cicli di imaging, esportare le immagini da ogni singolo canale come file TIF o JPG per l'assemblaggio e l'analisi delle immagini. In questa figura, una sezione di un femore di topo di tre mesi è stata colorata con blu di calceina e analizzata per il minerale accumulato, visto in bianco, e le etichette di mineralizzazione, viste in verde e rosso nel primo ciclo di imaging. I vetrini sono stati quindi ripresi per l'attività della trappola, vista in giallo nel secondo turno, e l'attività AP, vista in rosso nel terzo ciclo di imaging.

Infine, i vetrini sono stati colorati con blu toluidina nel quarto round. I marcatori di riferimento sono stati ripresi durante ogni ciclo di imaging, compreso il ciclo cromogenico, e sono stati allineati utilizzando il software personalizzato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno tempo di quello necessario per decalcificare un campione tipico.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre immagini di alta qualità ad alto contenuto di tessuti mineralizzati, che speriamo possano essere utilizzate più ampiamente dalla comunità muscolo-scheletrica.