Détermination de la puissance Relative d’un anticorps Monoclonal Anti-TNF (mAb) de neutralisants TNF en utilisant une méthode de Bioanalytical In Vitro

L’objectif global de cette procédure est de mesurer la puissance relative des molécules anti-TNF-alpha. Dans cet exemple, nous comparons deux anticorps monoclonaux anti-TNF-alpha afin de déterminer l’efficacité de neutralisation d’un anticorps monoclonal de référence par rapport à un échantillon d’anticorps monoclonal à l’étude. Ce tutoriel montre en détail les étapes de détermination du pouvoir de neutralisation du TNF-alpha, qui ne sont pas incluses dans la littérature.

Les cellules peuvent être stressées par différents facteurs environnementaux, par exemple, la famine. Chaque cellule a différentes protéines à sa surface appelées récepteurs. Certains d’entre eux sont spécifiques de la cytokine TNF-alpha.

Lorsque cette molécule interagit avec son récepteur et qu’un signal spécifique est développé, cette signalisation combinée à un facteur de stress environnemental subit une mort cellulaire programmée appelée apoptose. Cependant, en présence d’une molécule anti-TNF-alpha qui peut être un anticorps monoclonal, la cytokine peut être titrée par l’AcM, subissant un processus de neutralisation aidant les cellules à survivre. Ainsi, dans le cadre d’une méthodologie standardisée, la force de neutralisation d’une molécule peut être mesurée.

Ce protocole est actuellement effectué pendant cinq jours. Le premier jour, des solutions pour la culture cellulaire doivent être préparées. De plus, les cellules WEHI 164 seront décongelées et sous-cultivées.

Le deuxième et le troisième jour, la confluence des cellules doit être vérifiée. Après cette étape, les cellules doivent être détachées, comptées, la densité cellulaire ajustée et, enfin, les cellules doivent être cultivées à nouveau. Toutes ces étapes doivent être effectuées chaque jour.

Au quatrième jour, la concentration d’anticorps monoclonaux doit être déterminée par absorption UV et des dilutions d’anticorps doivent être effectuées. Des solutions d’induction d’apoptose seront préparées. Enfin, la densité cellulaire des cellules WEHI 164 doit être ajustée à un demi-million de cellules par ml.

Au cinquième jour, une solution de substrat pour la détection des cellules apoptotiques sera préparée et l’analyse spectrophotométrique sera effectuée. Enfin, l’analyse in silico des résultats sera abordée. Toutes les solutions employées dans ce protocole sont décrites dans cette diapositive.

Le premier jour, cette solution doit être préparée avant l’exécution du protocole à l’exception des solutions d’induction d’apoptose et de substrat qui doivent être utilisées immédiatement après la reconstitution. Au début de ce protocole, les cellules congelées doivent être retirées du récipient d’azote liquide. Ce flacon contenant des cellules WEHI congelées doit être conservé sur de la glace jusqu’à son utilisation.

Gardez votre lieu de travail propre et désinfecté avant d’exécuter toute activité afin d’éviter la contamination croisée. Transférez le support isotherme dans la hotte à flux laminaire et distribuez neuf ml de milieu de culture préchauffé dans un tube stérile de 15 millilitres. À l’aide d’un mL de milieu de culture préchauffé, laver les cellules WEHI 164 pour un pipetage doux de haut en bas jusqu’à ce que les cellules congelées se détachent du microtube.

Mélanger par inversion cinq fois jusqu’à ce que les cellules congelées dégèlent complètement. Ensuite, centrifugez les cellules à 125 g pendant trois minutes. Jetez le surnageant et désagrégez la pastille cellulaire.

Ajoutez cinq ml du milieu de culture préchauffé dans le tube et mélangez la suspension jusqu’à ce que les cellules soient complètement remises en suspension. Récupérez les cellules dans une fiole de culture T. Et incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius et dioxyde de carbone à 5 %. Chaque jour précédent pour détacher, compter les cellules de culture, il est obligatoire de vérifier la santé de la culture au microscope.

Le chercheur doit vérifier la santé, la viabilité et la densité cellulaire des cellules pour la sous-culture. Cette vérification doit également être effectuée pour le test biologique. Tout d’abord, il faut vérifier, l’absence de contamination biologique, par exemple, des bactéries.

Deuxièmement, la santé cellulaire peut être vérifiée par confluence. Une confluence supérieure à 90 % suffit pour obtenir de bons résultats. Cependant, si les cellules n’ont pas atteint la densité cellulaire souhaitée, le ballon doit être renvoyé dans l’incubateur et attendre que les cellules aient atteint la densité cellulaire et la confluence souhaitées.

Le milieu de culture vieilli doit être retiré de la fiole T. Lavez les cellules fixées sur les parois de la fiole T avec cinq mL de la solution de lavage des cellules. Veillez à ne pas retirer les cellules attachées.

Mélanger manuellement pour éliminer les résidus de milieu de culture et les débris cellulaires. Cette étape doit être exécutée deux fois. Enlever les solutions de lavage résiduelles à l’aide d’un aspirateur et ajouter trois mL de la solution de détachement de cellules.

Agiter et incuber pendant trois minutes. Une fois l’incubation terminée, ajoutez du milieu de culture préchauffé dans la fiole T afin d’inactiver l’enzyme. Et récupérer les cellules.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et centrifugez. Identifiez la pastille cellulaire et jetez le surnageant. L’élimination du milieu de culture vieilli est essentielle pour la culture de cellules saines.

Désagréger la pastille cellulaire et reconstituer les cellules avec cinq mL du milieu de culture préchauffé. Transférez 50 microlitres de suspension cellulaire dans un microtube. Comptez les cellules à l’aide de la méthode d’exclusion du bleu trypan.

Compter les cellules et déterminer la viabilité des cellules. Une fois que vous avez le nombre de cellules viables, ajustez 15 mL du milieu de culture à une densité cellulaire d’un demi-million de cellules par mL à l’aide de la formule suivante. Transvaser 15 mL de la suspension cellulaire ajustée dans un flacon de culture en T et incuber pendant la nuit.

Ce processus de culture global doit être répété au moins une fois de plus pour un total de trois passages cellulaires avant de commencer le test de neutralisation. Au quatrième jour, mesurer la densité optique de la substance de référence, de l’échantillon analytique et de l’échantillon témoin par absorption UV à 280 nanomètres. Effectuer une dilution initiale à deux milligrammes par mL avec un milieu de culture d’essai pour chaque échantillon par triplets indépendants.

Effectuez une deuxième dilution à deux microgrammes par mL pour chaque échantillon mAb. Distribuer 75 microlitres du milieu de culture d’essai dans les 60 puits présents au milieu d’une microplaque de polystyrène. Ajouter 230 microlitres de substance de référence dans les puits 2B et 2C.

Échantillons analytiques dans les puits, 2D et 2E. Et enfin, l’échantillon de contrôle dans les puits, 2F et 2G. Un échantillon de contrôle est une molécule dont la puissance relative est connue.

Faites ensuite des dilutions en série dans la microplaque. Un exemple est illustré dans les diapositives suivantes. N’oubliez pas de mélanger les solutions au préalable pour les distribuer dans les puits.

Cette opération est essentielle pour le succès de ce protocole. Ajustez auparavant à un demi-million de cellules par ml dans un distributeur. Ajoutez 50 microlitres de suspension cellulaire aux 60 puits internes de la plaque de test, en commençant par la colonne deux jusqu’à la 11e.

Mélangez préalablement la suspension cellulaire pour ajouter du liquide à la microplaque. Transférez immédiatement 50 microlitres de dilutions d’AcM sur la plaque de dosage. Pour les voies appariées, distribuez les dilutions en tournant autour de la micropipette.

Les dilutions d’AcM peuvent être distribuées dans les puits dans l’ordre suivant, les témoins étant distribués dans les puits environnants. Diluez le TNF-alpha avec 500 microlitres d’eau ultra-pure. Mélange par mélangeur vortex à 2200 tr/min.

Transvaser dans un tube de 15 mL et enfin, diluer à 40 nanogrammes par mL avec un milieu de culture d’essai. Distribuez 50 microlitres de la solution d’induction de l’apoptose dans les 60 puits de dosage internes. Distribuez 50 microlitres de la solution d’induction de l’apoptose dans les 60 puits de dosage internes.

Enfin, incubez pendant 16 heures. Le cinquième jour, reconstituez le substrat avec cette solution tampon comme indiqué dans les instructions du fabricant. Mélanger en inversant cinq fois.

Distribuer la solution de substrat. Et ajoutez 50 microlitres de la solution de substrat à chaque puits d’échantillon dans la plaque de dosage. Ajoutez également du substrat aux commandes.

Agitez la plaque de test dans un mélangeur vortex à 400 tr/min pendant trois minutes. Sortez la plaque de dosage du mélangeur et incubez à température ambiante. Allumez un lecteur-spectrophotomètre de plaques.

Ouvrez le logiciel SoftMax Pro ou tout autre programme équivalent. Chargez la microplaque dans le spectrophotomètre et ajustez les paramètres suivants. Activez la fonction de luminescence et la fonction Lire le type dans le point de terminaison.

Ajustez la zone de lecture, à l’exception des colonnes un et 12. Sélectionnez le type de plaque sur la microplaque à fond transparent standard de 96 puits. Modifiez le temps d’intégration jusqu’à 1250 millisecondes.

Ajustez le temps d’agitation de la microplaque à 10 secondes. Sélectionnez le puits dans lequel la substance de référence, la substance analytique et l’échantillon de contrôle seront placés. Commencez à lire.

Les résultats de ce test sont les courbes de réponse exprimées en luminescence par rapport aux échelles logarithmiques de la concentration d’AcM. Les points d’inflexion de ces courbes sont les concentrations effectives, CE50 pour chaque mAb. C ou CE50 est exprimé en nanogrammes par ml.

Cependant, cette valeur n’a pas de signification en soi, si elle n’est pas comparée à l’échantillon de référence. Ainsi, l’activité d’un échantillon analytique est exprimée en pourcentage et appelée activité relative. L’activité relative est la moyenne de trois résultats de microplaques indépendants, qui provient en conséquence de la valeur CE50 de chaque plaque.

La comparaison entre les échantillons de contrôle et les échantillons de référence permet de déterminer tout écart ou biais dans le test actuel. La comparaison d’un échantillon de référence avec un échantillon analytique permet de déterminer l’activité relative. Ce tableau montre l’activité relative des anticorps monoclonaux et son intervalle de confiance à 95 %De plus, il affiche l’écart-type relatif de chaque échantillon par rapport à l’activité de la substance de référence.

Un écart-type relatif supérieur à 15 % n’est pas jugé acceptable. Cette caractérisation permet de déterminer a priori, le comportement biotique d’une molécule en cours de développement avant de mener des essais cliniques coûteux et chronophages. Il est également utile pour la libération d’un lot à l’autre d’un produit approuvé.

Nous sommes d’avis que ces tests sont utiles pour déterminer si une molécule a un effet biologique adéquat en ce qui concerne son mécanisme d’action. Dans le cadre des méthodes biophysiques, cette méthodologie est capable de déterminer par des moyens biologiques la puissance et l’efficacité de la qualité et des attributs d’un médicament, montrant ainsi une signification complète et pleine de ses fonctions effectrices.