Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

צלבים גנטיים

Overview

כדי לנתח תהליכים גנטיים או ליצור אורגניזמים עם סוויטות תכונות חדשניות, מדענים יכולים לבצע צלבים גנטיים, או הזדווגות תכליתית של שני אורגניזמים. רקומבינציה מחדש של חומר גנטי הורי בצאצאים מאפשרת לחוקרים להסיק את הפונקציות, האינטראקציות והמיקומים של הגנים.

סרטון זה יבחן כיצד צלבים גנטיים השפיעו על פיתוח שלושת חוקי הירושה של מנדל, המהווים את הבסיס להבנתנו את הגנטיקה. טכניקת חצייה גנטית אחת שפותחה לראשונה עבור אורגניזמים חד-תאיים כגון שמרים, המכונה ניתוח טטראד, תוצג לאחר מכן בפירוט, ואחריה כמה דוגמאות לאופן שבו הכלי הקלאסי הזה משמש במחקרים גנטיים כיום.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

צלב גנטי הוא ההזדווגות התכליתית של שני אנשים וכתוצאה מכך שילוב של חומר גנטי בצאצאים. צלבים יכולים להתבצע במערכות מודלים רבות – כולל צמחים, שמרים, זבובים ועכברים – וניתן להשתמש בהם כדי לנתח תהליכים גנטיים או ליצור אורגניזמים בעלי תכונות חדשניות.

וידאו זה יכסה כמה מעקרונות הצלבות גנטיות, יבחן שיטה אחת לביצוע צלבים המכונים ניתוח טטראד, וידון במספר יישומים של טכניקה זו.

ראשית, בואו להציג את העקרונות הבסיסיים של ירושה שהופכים צלבים גנטיים אפשריים.

פנוטיפ של אורגניזם, או הרכב התכונות, מושפע מההרכב הגנטי או הגנוטיפ שלו. ברוב האורגניזמים המתרבים מינית, דור ההורים מייצר תאי הגיפט האפואידים, שיש להם עותק אחד של כל כרומוזום נפרד. לאחר מכן, אלה מתמזגים במהלך ההזדווגות כדי לייצר צאצא דיפלואידי עם שני עותקים הומולוגיים של כל כרומוזום. אם שני הכרומוזומים מכילים את אותו אלל, או צורה משתנה של גן, אז האורגניזם הוא "הומוזיגוס" באותו לוקוס גנטי; אחרת, זה "הטרוזיגוס".

כדי להתחיל את המחזור מחדש, האורגניזם הדיפלואידי שוב מייצר גיימטים הופלואידים באמצעות מיוזה. במהלך תהליך זה, שני הכרומוזומים ההומולוגיים עוברים "רקומבינציה", שבה פיסות של רצפים מקבילים מוחלפות בין השניים. תהליך זה מערבב את אללי ההורים שירשו על ידי כל צאצא, ובכך מגדיל את המגוון הגנטי שלהם.

אחד האנשים הראשונים שביצעו צלבים גנטיים שיטתיים היה "אבי הגנטיקה", גרגור מנדל. על ידי שימוש בצמח האפונה שניתן לתמרן בקלות, ובחינת שורה של תכונות עם דפוסי ירושה עקביים, הצליח מנדל לגזור שלושה חוקי ירושה בסיסיים שיהוו את הבסיס לגנטיקה.

החוק הראשון של מנדל הוא חוק האחידות, הקובע כי הצאצא ההטרוזיגוטה של הדור הראשון, או F1, של שני אנשים הומוזיגוס יהיה פנוטיפ של הורה אחד בלבד. אלל הקמת פנוטיפ זה נקרא "דומיננטי", בעוד אלל "מוסתר" הוא "רצסיבי". כיום אנו יודעים שמערכות יחסים דומיננטיות הן לעתים קרובות פחות ברורות, עם מקרים כגון דומיננטיות לא שלמה, שבהם הטרוזיגוטים מבטאים פנוטיפ מעורב; ודומיננטיות, שבה שני הפנוטיפים מוצגים.

חוק ההפרדה קובע כי אלל אחד מוקצה באופן אקראי לכל משחק. על ידי התבוננות כי צאצאי F2 מן ההפריה העצמית של אנשים הטרוזיגוטה F1 הציג יחס פנוטיפי 3:1, אבל כי שניים של אנשים דומיננטיים פנוטיפי הם למעשה הטרוזיגוטים, מנדל הסיק כי שני אללים הוריים יש לעבור בירושה בנפרד. כיום, אנו יודעים כי ההפרדה מתרחשת במהלך מיוזה, כאשר שני הכרומוזומים ההומולוגיים של ההורה הדיפלואיד מחולקים באופן אקראי לתאי בת פלואידית, כל אחד יורש אחד משני אללים.

החוק השלישי של מנדל הוא חוק המגוון העצמאי, הקובע כי תכונות אישיות עוברות בירושה עצמאית. כיום אנו יודעים כי עצמאות מוחלטת קיימת רק עבור תכונות הנשלטות על ידי גנים על כרומוזומים נפרדים בסט ההפלואידים, המופצים באופן עצמאי לתאי בת במהלך מיוזה. עבור שני גנים על אותו כרומוזום, המרחק ביניהם הוא ביחס הפוך לסבירות שהם מתאחדים מחדש על כרומוזומים הומולוגיים שונים, ובהרחבה, מה הסבירות שהם יירשו יחד באותו צאצא. לכן, ניתוח ארבעת המוצרים המיאוטיים של אורגניזם דיפלואיד מספק דרך למדענים למפות את מיקום הגנים.

לאחר סקירת העקרונות מאחורי צלבים גנטיים, בואו נסתכל על פרוטוקול לניתוח tetrad.

טכניקה זו מיושמת בדרך כלל על אצות או פטריות מסוימות של תאים בודדים, כגון שמרים, כדי לנתח את ארבעת המוצרים המיאוטיים ההפלואידיים, או נבגים, אשר במינים אלה נשארים יחד כ"טטרד "בתוך גוף תא אחד.

כדי לבצע ניתוח tetrad בשמרים, הזנים הרצויים גדלים לראשונה על מדיה מתאימה. תאי שמרים ממושבות בודדות מורשים להזדווג, למשל על ידי פסים של כל זן בתבנית צולבת על צלחת חדשה. צלחת זו מצופה לאחר מכן העתק על מדיה סלקטיבית כדי לבודד רק את המוצר diploid של הצלב.

תאים דיפלואידים נבחרים גדלים על מדיה עניים בחומרים מזינים כדי לגרום לנבג ולהיווצרות טטרד. האסי, שהם המבנים המחזיקים בטטרדרד של נבגים, מתעכלים בפתרונות המכילים את הזימוליאז האנזים. לאחר העיכול, asci בודדים הם מניפולציה באמצעות מיקרוסקופ ניתוח tetrad. הם מסודרים במקומות ספציפיים על צלחת צמיחה, ומשבשים כדי לשחרר את הנבגים הבודדים. אלה יכולים להיות ממוקמים לתוך דפוס דמוי רשת, שבו כל נבג יפיק מושבה בודדת שניתן לנתח עוד יותר.

עכשיו שאתה יודע איך ניתוח tetrad מבוצע, בואו נבחן כמה יישומים רבים או שינויים של טכניקה זו.

ניתוח ידני של טטרדים גוזל זמן רב, וחוקרים המציאו חלופות בעלות תפוקה גבוהה, כגון רצף של טטרדרים התומכים בברקוד. בשיטה זו, הצאצא הדיפלואיד של צלב שמרים השתנה עם ספריית פלסמידים, שכל אחד מהם מכיל רצף קצר וייחודי המכונה "ברקוד" הפועל כמזהה עבור כל צאצא. הפלסמידים מבטאים גם GFP, ומאפשרים לבחור אסצי שמרים באמצעות ציטומטריית זרימה ולמיין על לוחות אגר. ה- asci הונחו בהמוניהם על הצלחות, והנבגים הורשו לגדול למושבות קטנות. המושבות חולקו באקראי ללוחות של 96 בארות עבור גנוטיפינג. ברקוד הרצף הייחודי מאפשר לחוקרים לקבץ את ארבע המושבות שעלו מנבגים מכל טטרד.

צלבים גנטיים יכולים לשמש גם כדי ליצור תאי שמרים עם מספר גדול של מחיקות גנים. בתהליך המפלצת הירוקה, שמרים מוטנטיים haploid נושא מחיקות גנים שונים מסומן על ידי GFP הם מזווגים ומנוצלים. צאצאי הפלואידים אלה, שחלקם נושאים מחיקות שירשו משני ההורים, ממוינים באמצעות ציטומטריית זרימה המופעלת על ידי פלואורסצנטיות, שם הוכח כי עוצמת GFP תואמת את מספר המחיקות הקיימות בזן שמרים מסוים. תאים נבחרים אלה היו אז בתרבית ו חצו מחדש. חוזר על מחזור זה שנוצר זני שמרים המכיל מחיקות רבות.

לבסוף, צלבים גנטיים הותאמו לשימוש במערכות מודל רבות, כגון טפיל תאיים גורם מלריה Plasmodium. מכיוון שהטפיל יכול להתרבות רק בתוך תאים אחרים, כל שלבי החצייה חייבים להתבצע בעכברים או יתושים, הפונדקאי הטבעי של הטפיל והווקטור, בהתאמה. כאן, עכברים נדבקו בשני זני פלסמודיום ייחודיים בשלב טפיל הדם. הטפילים הועברו לאחר מכן ליתושים באמצעות האכלת דם, ופעם בפנים הם התבגרו לגמטות שהיו מפרות כדי ליצור זיגוטים דיפלואידים. לאחר מכן נקצרו הספורוזוזיטים הבוגרים מהיתוש ושימשו להדבקת עכברים נאיביים, שם הופצו הטפילים לבידוד הצאצאים הצולבים של העניין.

הרגע צפית בסרטון של ג'וב על צלבים גנטיים. בסרטון זה הצגנו את עקרונות הירושה, כיצד ניתן לנתח צלבים גנטיים באורגניזמים מסוימים עם ניתוח טטראד, וכמה יישומים נוכחיים. כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter