Évaluation de la Contamination d’ADN dans les échantillons d’ARN issu de l’ADN ribosomique

L’objectif global de cette méthode est de retracer la contamination d’échantillons d’ADN et d’ARN génomiques obtenus à partir de tissus végétaux pour une PCR quantitative en temps réel. La méthode utilise la région espaceuse transcrite interne des gènes ribosomiques pour une détection fiable et sensible de la contamination par l’ADN dans la famille des Poacées. Cette méthode peut contribuer à améliorer la méthode largement utilisée de la PCR quantitative en temps réel par transcription inversée.

Les principaux avantages sont l’utilisation de gènes multicopies pour améliorer la sensibilité à la détection chez les espèces eucaryotes et procaryotes et c’est aussi un moyen rentable. Les gènes ribosomiques sont constitués des deux ITS, à savoir ITS1 et ITS2, et des trois gènes codant pour l’ARN, les sous-unités 17-18S, 5.8S et 25-28S. Nous présentons ici un protocole de détection de la contamination par l’ADN dans des échantillons d’ARN de l’espèce Aeluropus littoralis de Poacées.

Dans le protocole présenté, deux stratégies complémentaires ont été utilisées pour la conception d’amorces basées sur l’ADNr. D’une part, des amorces spécifiques à l’espèce ont été sélectionnées à partir des séquences d’ITS et d’autre part, des amorces universelles ont été sélectionnées à partir des séquences flanquant les ITS. Pour valider l’applicabilité de l’amorce, l’ADN génomique doit également être inclus dans le flux de travail qRT-PCR une largeur croisée vers l’isolement et la validation de l’ARN.

Après avoir isolé l’ADN et l’ARN, analysez un gel d’agarose au thiocyanate de guanidinium dans des conditions dénaturantes pour vérifier la quantité, la pureté et l’intégrité de l’ARN isolé des tissus foliaires. Pour faire le gel, refroidissez d’abord la gélose à 60 degrés Celsius, puis mélangez cinq millimolaires de thiocyanate de guanidinium avec du gel d’agarose TBE standard à 1 %. Ensuite, préparez le tampon de charge de dénaturation de l’ARN.

Ajouter un à cinq microgrammes d’ARN total et un tampon de charge dénaturant de l’ARN. Ensuite, chauffez l’échantillon de mélange à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes et conservez-le sur de la glace avant de charger le gel. Chargez l’échantillon et faites fonctionner le gel à 100 volts pendant 45 minutes.

Pour voir deux bandes d’ARN distinctes, utilisez un système de capture d’images sous lumière ultraviolette. Éliminez les traces d’ADN génomique de l’ARN dans un tube sans RNase en ajoutant une unité d’ADNASE1 et du chlorure de magnésium contenant un tampon de réaction 10 fois plus élevé à 0,1 à un microgramme d’ARN total. Ensuite, incubez le mélange à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Arrêtez la réaction en ajoutant un microlitre d’EDTA de 50 millimolaires. Et puis, incubez le mélange à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Pour éliminer les traces d’ARN de l’extrait d’ADN génomique, ajoutez cinq microlitres de 10 milligrammes par millilitre de RNnase A à l’ADN total et incubez à 37 degrés Celsius pendant une heure.

Ensuite, conservez les extraits d’ARN et d’ADN à moins 80 degrés Celsius. La fonctionnalité des amorces conçues doit être validée en effectuant une qPCR en utilisant l’ADNg comme matrice. Préparez le mélange maître PCR dans un tube maintenu sur de la glace en mélangeant tous les réactifs sauf la matrice d’ADN.

Aliquote du mixage maître dans une plaque optique à 96 puits. Ensuite, ajoutez un microlitre d’ADN génomique dans chaque puits et recouvrez la plaque d’un film d’étanchéité de plaque optique. Faites tourner la plaque et conservez-la dans un thermocycleur.

Réglez un programme en cours d’exécution pendant 40 cycles et démarrez le thermocycleur en temps réel. Effectuez l’acquisition de données à 60 degrés Celsius. Pour confirmer la spécificité de l’amorce, analysez les données de la courbe de fusion à l’aide d’un cycle à seuil unique et d’une méthode d’ajustement de courbe soustraite.

Un pic individuel pointu représente un seul amplicon uniforme. Utilisez un gel d’agarose à 3 % pour valider la taille de chaque amplicon. Mélangez cinq à 10 microlitres de produit PCR avec un tampon de chargement six fois, et chargez les échantillons à côté de l’échelle d’ADN sur le gel d’agarose.

Effectuer une électrophorèse à 100 volts pendant 45 minutes et un tampon EDTA tris-borique à un pli. Voici le schéma de la plaque d’amplification et du test de contamination par l’ADNg. Effectuez tous les tests en au moins trois répétitions.

Vérifiez la RNase par au moins une amorce universelle ou spécifique à base d’ADNr. Incluez de l’ADN génomique de contrôle positif pour chaque mélange maître de paires d’amorces. Incluez des commandes non liées au modèle pour chaque master mix de paire d’amorces.

Préparez le mélange maître PCR dans un tube maintenu sur de la glace en mélangeant tous les réactifs à l’exception de la matrice d’ARN. Aliquote du mixage maître dans une plaque optique à 96 puits. Ensuite, ajoutez un microlitre d’ARN dans chaque puits et recouvrez la plaque d’un film d’étanchéité de plaque optique.

Centrifugez et conservez la plaque dans le thermocycleur. Définissez un programme de 40 cycles et démarrez le thermocycleur en temps réel. Analysez les données à 60 degrés Celsius.

Validez tous les amplicons en exécutant un gel d’agarose à 3 %. Décongeler l’ARN traité avec des réactifs de synthèse de DNase et d’ADNc à température ambiante. Après la décongélation, faites tourner les réactifs.

Ensuite, dans un tube sans nucléase, ajoutez un microgramme d’ARN et un microlitre d’amorce d’oligo-désoxythymidine 18, également appelée Oligo(dT) et ajustez le volume final à 12 microlitres avec de l’eau sans RNase. Mélangez doucement les réactifs et maintenez-les sur de la glace. Incuber la réaction à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes pour faire fondre les structures secondaires de l’ARN.

Ensuite, faites tourner les échantillons et transférez immédiatement le flacon sur de la glace. Ajoutez des réactifs de synthèse d’ADNc dans un tube maintenu sur de la glace. Mélangez délicatement les réactifs.

Ensuite, ajoutez 19 microlitres de mélange principal dans un tube PCR contenant de l’ARN. Incuber la réaction à 42 degrés Celsius pendant 60 minutes. Et puis, à 70 degrés Celsius pendant cinq minutes pour arrêter l’activité de la transcriptase de réserve.

Ensuite, gardez les tubes sur de la glace. Effectuez une analyse de routine de l’expression génique de toutes les réactions PCR en analysant les courbes de fusion et en validant les amplicons sur gel d’agarose à 3 %. Une recherche BLAST effectuée pour extrapoler l’alignement de la séquence de la petite sous-unité 5.8S et des amorces de grande sous-unité montre un motif basé sur l’homologie de séquence de 2 000 espèces de plantes vertes.

Courbes de fusion représentatives réalisées montrant des pics aigus uniques pour l’espaceur interne transcrit un flanquant les amplicons chez différentes espèces de Poacées. L’axe X de la courbe de fusion indique la température et l’axe Y fait référence à la différence de fluorescence. Les pics de couleur rose représentent les amplicons, et la ligne rouge représente les contrôles sans modèle dans chacun des tracés.

Courbes de fusion représentatives montrant la présence de pics aigus sans dimères d’amorce pour l’espacement interne transcrit - deux amplicons flanquants chez différentes espèces de Poaceae. L’axe X de la courbe de fusion indique la température et l’axe Y fait référence à la différence de florescence. Les pics de couleur verte représentent les amplicons, et les oranges représentent les contrôles sans modèle dans chacun des tracés.

Un gel représentatif d’agarose à 3 % montrant des produits PCR basés sur l’ADN ribosomique fonctionnant le long d’une échelle d’ADN de 100 BP. Les bandes d’ADN du panneau A représentent l’amplicon de la région flanquante interne transcrite de l’espacement un. Les bandes d’ADN dans les panneaux B et C représentent des amplicons de l’espaceur interne transcrit de la région flanquante deux.

Une région d’espacement interne transcrite pour différentes espèces. La présence d’une courbure ou d’un pic dans les échantillons d’ARN est le résultat d’une contamination par l’ADNg, tandis que l’apparition d’une courbure ou d’un pic dans la réaction NTC est probablement liée à la formation de dimères d’amorce. Il est recommandé de tester d’abord tous les échantillons d’ARN à l’aide d’amorces à base d’ADNr pour s’assurer que les échantillons contaminés ne sont pas utilisés pour des applications en aval.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être complétée en huit heures si elle est correctement exécutée. Cette méthode a ouvert la voie aux chercheurs pour quantifier l’ARNm par PCR quantitative en temps réel. Après avoir regardé cette vidéo, on devrait avoir une bonne compréhension de la façon dont les contaminations à l’ADN génomique peuvent être détectées à l’aide de la méthode que nous proposons.

N’oubliez pas que travailler avec du thiocyanate de guanidinium et du bromure d’éthidium est extrêmement dangereux et que vous devez toujours porter des vêtements de protection et prendre des mesures de protection.