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Immunoprecipitazione della cromatina
 
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Immunoprecipitazione della cromatina

Overview

Gli istoni sono proteine che aiutano a organizzare il DNA nei nuclei eucariotici fungendo da "impalcature" attorno alle quali il DNA può essere avvolto, formando un complesso chiamato "cromatina". Queste proteine possono essere modificate attraverso l'aggiunta di gruppi chimici e questi cambiamenti influenzano l'espressione genica. I ricercatori utilizzano una tecnica chiamata immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per capire meglio quali regioni del DNA si associano a specifiche modificazioni istoniche o ad altre proteine regolatrici geniche. Gli anticorpi vengono utilizzati per isolare la proteina di interesse e il DNA legato viene estratto per l'analisi.

Qui, JoVE presenta i principi alla base di ChIP, discutendo specifiche modificazioni istoniche e la loro relazione con l'espressione genica e l'organizzazione del DNA. Esaminiamo quindi come eseguire un protocollo ChIP ed esploriamo i modi in cui gli scienziati stanno attualmente utilizzando questa tecnica.

Procedure

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L'immunoprecipitazione della cromatina, o "ChIP", è una tecnica utilizzata dai ricercatori per valutare le interazioni proteina-DNA. I fattori proteici svolgono un ruolo importante nella regolazione genica; non solo organizzano il DNA nei cromosomi, ma si legano anche a specifiche sequenze di DNA, chiamate siti regolatori, per attivare o reprimere l'espressione. Durante la ChIP, la cromatina, che consiste di DNA e delle sue proteine associate, viene "immunoprecipitata", il che significa che viene isolata attraverso l'uso di anticorpi. Con questo metodo, i ricercatori possono valutare quali proteine si associano a quali sequenze di DNA.

In questo video, esamineremo le modificazioni della cromatina e il loro ruolo nella regolazione epigenetica e come ChIP può saggiare queste modifiche. Descriveremo quindi una procedura generalizzata per questa tecnica e infine discuteremo di come gli scienziati stanno usando ChIP nella ricerca di oggi.

Iniziamo rivedendo quali sono le modifiche della cromatina e come studiarle con ChIP.

Negli eucarioti, il DNA viene immagazzinato nei nuclei essendo "avvolto" attorno a complessi proteici. Queste proteine sono istoni e ogni complesso istonico avvolto nel DNA viene definito "nucleosoma". L'espressione genica è regolata dall'"occupazione del nucleosoma" o se un tratto di DNA è racchiuso in nucleosomi. Il DNA trascritto tende ad essere localizzato in regioni "prive di nucleosomi", che consentono alle proteine di associarsi ai siti regolatori di un gene e consentono all'RNA polimerasi di effettuare la trascrizione.

Le prove attuali suggeriscono che i cambiamenti nella struttura della cromatina che regolano l'espressione genica sono mediati da modifiche chimiche apportate agli istoni, di solito nelle loro "code" che si muovono liberamente. I più comuni di questi sono i gruppi acetil, metile e fosfato che vengono aggiunti o rimossi da specifici amminoacidi e si osserva che queste diverse modificazioni istoniche sono associate a diversi livelli o modalità di espressione genica.

Ad esempio, l'aggiunta di tre gruppi metilici al 27 ° residuo di lisina nella subunità istonale H3 - una modifica chiamata H3K27me3 - è stata collegata al silenziamento genico. In alternativa, la modificazione H3K9ac, in cui un gruppo acetilico viene aggiunto al 9 ° residuo di lisina sull'istone H3, è stata associata all'attivazione genica.

Si ipotizza che le modificazioni isoniche svolgano un ruolo nella regolazione epigenetica dell'espressione genica marcando le regioni della cromatina come "attive" o "silenziose". Un meccanismo con cui si ritiene che le modificazioni isoniche esercitino i loro effetti è quello di reclutare fattori di trascrizione o enzimi di "rimodellamento" della cromatina, l'ultimo dei quali sposta fisicamente le posizioni dei nucleosomi.

Con ChIP, specifiche modificazioni istoniche possono essere prese di mira da anticorpi, che possono essere "tirati giù" insieme al DNA circostante. I ricercatori possono quindi utilizzare PCR, microarray o sequenziamento per identificare le regioni del DNA associate a modificazioni istoniche di interesse. Variando gli anticorpi utilizzati durante la ChIP, questa tecnica può anche aiutare a individuare le regioni del DNA legate da fattori di trascrizione e altre proteine regolatrici.

Ora che conosci i principi alla base di ChIP, passiamo attraverso una procedura generalizzata per questa tecnica.

Per iniziare, le cellule di interesse vengono raccolte e trattate con sostanze chimiche come la formaldeide, che agiscono come reagenti di "cross-linking" e aiutano ad apporre proteine alle sequenze di DNA a cui si associano facilitando la formazione di legami covalenti tra di loro. Bisogna fare attenzione a non "trattare troppo" le cellule con formaldeide, in quanto ciò può influire sulla capacità degli anticorpi di riconoscere le loro modificazioni istoni target nelle fasi successive della ChIP. Per fermare il processo di reticolazione, la glicina viene aggiunta alla soluzione di formaldeide con cui vengono trattate le cellule. Le cellule vengono quindi raccolte e lizzate per rilasciare la cromatina.

Per solubilizzare la cromatina e definire con precisione le regioni del DNA che si associano agli istoni modificati, la cromatina viene "tranciata" meccanicamente in pezzi più piccoli usando onde sonore, un processo chiamato sonicazione. In genere, gli scienziati mirano a creare frammenti di cromatina da 200 a 1000 coppie di basi di lunghezza. Una volta generati frammenti di cromatina della dimensione desiderata, un anticorpo viene aggiunto alla soluzione e la miscela viene incubata per dare all'anticorpo il tempo di riconoscere la sua modifica dell'istone bersaglio.

Le perle magnetiche a cui gli anticorpi possono legarsi vengono quindi introdotte nella miscela, immobilizzando i complessi di cromatina associati agli anticorpi. Le perle vengono raccolte attraverso l'uso di rack magnetici e lavate più volte per risciacquare eventuali cromatina o anticorpi non legati.

Per rilasciare la cromatina da loro, le perle vengono poste in una soluzione contenente il detergente SDS e, dopo aver raccolto le perle con un magnete, viene conservato il surnatante. L'enzima proteinasi K viene quindi aggiunto a questa soluzione per degradare tutte le proteine, compresi gli istoni, in modo che la componente DNA della cromatina possa essere isolata. Il DNA risultante viene quindi purificato e analizzato.

Diamo ora un'occhiata a come gli scienziati stanno attualmente utilizzando ChIP nei loro laboratori.

Molti ricercatori usano ChIP per valutare i cambiamenti nelle modifiche degli istoni causati da segnali extracellulari. Qui, le cellule umane coltivate sono state trattate con una citochina specifica, o molecola di segnalazione, e sono stati valutati i cambiamenti nella metilazione degli istoni. Analizzando il DNA ChIP con PCR in tempo reale, i ricercatori hanno determinato che, in risposta al trattamento, il gene codificante il fattore di trascrizione IRF1 ha ottenuto un segno istonale attivante, H3K36me3. Questa modifica ha permesso sia a una proteina regolatrice che alla RNA polimerasi II di associarsi a IRF1, con conseguente sua trascrizione.

ChIP può anche essere utilizzato per ottenere informazioni sui cambiamenti nell'espressione genica che si verificano durante le lesioni e la rigenerazione dei tessuti. In questo esperimento, i ricercatori hanno danneggiato un componente del sistema nervoso periferico nei topi – il nervo sciatico – e poi hanno usato ChIP per cercare nuove interazioni DNA-proteina in altre strutture del sistema nervoso periferico, come i gangli che fiancheggiano il midollo spinale. Gli scienziati hanno concluso che a seguito di lesioni nervose, la proteina p53, che è un regolatore della riparazione del DNA, è stata associata a un gene implicato nella rigenerazione dei tessuti, GAP43.

Infine, alcuni scienziati stanno lavorando per semplificare le procedure ChIP per aumentare la produttività e l'efficienza degli esperimenti. Qui, i ricercatori sono stati in grado di "automatizzare" ChIP, facendo eseguire a una macchina molti dei passaggi del protocollo. Ciò ha permesso ai ricercatori di valutare contemporaneamente il DNA associato a diverse modifiche degli istoni, utilizzando un numero relativamente piccolo di cellule - 10.000 - producendo risultati simili a quelli osservati con numeri di cellule più grandi o con tecniche ChIP standard "manuali".

Hai appena visto il video di JoVE sull'immunoprecipitazione della cromatina. In questo video, abbiamo discusso di come il DNA e le proteine insieme formano la cromatina e dei passaggi di un protocollo, chiamato ChIP, che può essere utilizzato per identificare sequenze di DNA associate a specifici stati o proteine della cromatina. Abbiamo anche esplorato come i ricercatori stanno usando e modificando ChIP per comprendere meglio il ruolo delle interazioni DNA-proteina durante la regolazione genica. Come sempre, grazie per aver guardato!

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