Przewlekły autoimmunologiczny model szczura z suchym okiem ze wzrostem liczby efektorowych limfocytów T pamięci w tkance gałki ocznej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie klinicznych objawów dysfunkcji łez oraz zapalenia gruczołu łzowego u szczurów poprzez podskórną immunizację oraz podspojówkowe i wewnątrzgruczołowe wstrzyknięcia ekstraktów z gruczołu łzowego, w celu oceny terapii w autoimmunologicznym zespole suchego oka. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące suchego oka, np. czy leki hamujące limfocyty T w chorobach autoimmunologicznych są skuteczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że wywołuje ona objawy choroby oczu podobne do ludzkiego suchego oka, a także umożliwia ilościowe określenie liczby limfocytów T infiltrujących gruczoł łzowy i oko.

Wnioski płynące z tego modelu zwierzęcego rozszerzają wiedzę na temat migracji limfocytów, ponieważ możliwe jest badanie śledziony oraz węzłów chłonnych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na brak odpowiedniego oprzyrządowania do dokumentowania zmian w małym oku szczura. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ niektóre etapy są trudne do opanowania z powodu szybkiego wysychania oka szczura oraz braku mrugania po znieczuleniu.

Po uśmierceniu samicy szczura linii Sprague Dawley zgodnie z protokołem tekstowym, należy położyć zwierzę płasko z jednym uchem opartym o stół, a drugim skierowanym do góry. Za pomocą nożyczek należy wykonać nacięcie o długości 10 mm w kierunku górno-dolnym pod odsłoniętym uchem. Następnie należy usunąć gruczoł łzowy, oddzielając go od otaczającej tkanki łącznej oraz od przewodu odpływowego.

Następnie, używając nożyczek, posiekaj tkankę na lodzie tak drobno, jak to możliwe. Następnie dodaj 150 µL PBS z 1X inhibitorem proteaz na każdą gruczoł łzowy. Przy ustawieniach sonikatora: 10 sekund włączony, 10 sekund wyłączony oraz amplituda 30%, sonikuj próbki na lodzie w częstotliwości 20 kHz przez pięć minut.

Następnie odwiruj sonikowane próbki przy 13 000 ×g i temperaturze 4 °C przez 20 minut. Przenieś nadsącz do nowej probówki. Następnie rozdziel nadsącz do probówek o pojemności 1,5 ml i przechowuj je w temperaturze -80 °C.

Przenieś pełny adiuwant Freunda zawierający 5 mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra lub niepełny adiuwant Freunda do probówki o pojemności 50 mL, dbając o to, aby objętość adiuwantu i mieszaniny antygenów pozostawała w stosunku jeden do jednego. Dodawaj kroplami mieszaninę antygenów zawierającą 2 mg/mL owalbuminy oraz 10 mg/mL ekstraktu z gruczołu łzowego do roztworu adiuwantu, mieszając na wirówce typu vortex z najwyższą prędkością, która nie powoduje rozlania cieczy. Kontynuuj mieszanie przez pięć minut po dodaniu całego antygenu.

Przenieś emulsję do strzykawki o pojemności 5 ml i za pomocą łącznika do strzykawek połącz ją z drugą strzykawką o pojemności 5 ml. Następnie przepychaj emulsję z jednej strzykawki do drugiej, aby ją wymieszać. W dniu zero rozdziel 200 µL emulsji, zawierającej 1 mg ekstraktu z gruczołu łzowego i 200 µg owalbuminy w kompletnym adjuwancie Freunda, do strzykawek o pojemności 1 ml z końcówką Luer lock i wyposaż strzykawki w igły o rozmiarze 27 G.

Bez stosowania znieczulenia wstrzyknąć emulsję podskórnie u podstawy ogonów szczurów. Następnie, w 14. dniu, w podobny sposób wstrzyknąć 200 µl tego samego antygenu w niepełnym adjuwancie Freunda. Tego samego dnia wstrzyknąć dootrzewnowo 300 ng toksyny krztuśca w 100 µl PBS.

W 48. dniu odważ wymaganą ilość owalbuminy i rozpuść ją w PBS. Następnie połącz owalbuminę z rozmrożonym ekstraktem z gruczołu łzowego, przygotowanym wcześniej w tym filmie, tworząc roztwór antygenu zawierający 1 mg/mL owalbuminy i 1 mg/mL ekstraktu z gruczołu łzowego. Po znieczuleniu szczura wstrzyknij 5 µL antygenu do podspójnówki forniksa oka.

Następnie wstrzyknij 20 µL antygenu do gruczołu łzowego. Trzymając znieczulonego szczura zgodnie z protokołem tekstowym, aby zmierzyć objętość łez za pomocą nici z czerwienią fenolową, użyj jednej pęsety do przytrzymania nici, a drugiej do odciągnięcia dolnej powieki szczura. Umieść nić w przyśrodkowym kącie dolnego sklepienia spojówki na jedną minutę, a następnie wyjmij nić.

Następnie należy umieścić nitkę obok linijki z podziałką milimetrową i wykonać zdjęcie długości zwilżonej części nitki. Aby zmierzyć gładkość filmu łzowego rogówki, należy umieścić szczura pod stereomikroskopem wyposażonym w oświetlacz pierścieniowy i kamerę. Następnie na rogówkę szczura należy nanieść 5 µL soli fizjologicznej.

Palcami w rękawiczkach wykonaj pasywne mruganie, przesuwając górną i dolną powiekę około pięć razy, aby rozprowadzić sól fizjologiczną. Przy powiększeniu 1,6-krotnym skup wiązkę oświetlacza pierścieniowego na środku powierzchni rogówki. Następnie, po 10 sekundach, wykonaj zdjęcia fotograficzne.

W celu pomiaru uszkodzeń rogówki należy przeprowadzić skanowanie fluoresceiną, dodając 2 µL 0,2% fluoresceiny do rogówki szczura. Palcem w rękawiczce należy pasywnie otworzyć i zamknąć powieki szczura trzy razy, aby rozprowadzić barwnik fluoresceinowy na powierzchni oka. Po jednej minucie należy użyć strzykawki o pojemności 3 mL, aby pobrać 1 mL soli fizjologicznej.

Następnie umieść strzykawkę około dwóch do trzech milimetrów przed rogówką i delikatnie nanieś sól fizjologiczną na oko. Po wyłączeniu światła tła wykonaj obrazy za pomocą filtra kobaltowo-niebieskiego w mikroskopie do obrazowania oka. Po eutanazji szczura zgodnie z protokołem tekstowym, za pomocą nożyczek usuń górną i dolną powiekę.

Uwolnij gałkę oczną poprzez przecięcie mięśni pozagałkowych, nerwu wzrokowego oraz spojówki fornix. Wykonaj nacięcie, aby otworzyć gałkę oczną. Usuń soczewkę wraz z ciałem szklistym.

Następnie wypreparowane gałki oczne umieść w probówkach o pojemności 1,5 ml na lodzie. Na koniec pobierz gruczoły łzowe zgodnie z opisem przedstawionym wcześniej w tym filmie. Na tej rycinie przedstawiono reprezentatywne obrazy nici z czerwienią fenolową pobranych od szczura kontrolnego i szczura z DED.

Długość nici z czerwienią fenolową w grupie DED jest krótsza niż w grupie kontrolnej, co wskazuje na mniejszą objętość filmu łzowego. Fluoresceina wiąże się z uszkodzonym nabłonkiem rogówki, dlatego jest wykorzystywana do pomiaru zakresu uszkodzeń. W tym eksperymencie plamki fluoresceiny na powierzchni rogówki szczurów z DED oceniano w skali od zera do dwóch i porównywano ze szczurami kontrolnymi.

Szczury z DED wykazują silniejsze barwienie fluoresceiną niż szczury kontrolne, co sugeruje uszkodzenie rogówki. Jak tu widać, jeśli powierzchnia rogówki jest gładka, a stabilność filmu łzowego wysoka, obraz pierścienia iluminatora na powierzchni oka jest okrągły i idealny. Zniekształcenie obrazu wskazuje na zmniejszoną gładkość rogówki i niestabilność filmu łzowego, co zaobserwowano w stopniu większego zniekształcenia w grupie DED.

Niniejsza analiza cytometryczna z przepływem wskazuje, że dominującym podzbiorem limfocytów T w prawidłowych tkankach gałki ocznej szczura są komórki T pamięci efektorowej. W gałkach ocznych szczurów z DED około 70% CD3-dodatnich limfocytów T to komórki T pamięci efektorowej, podczas gdy u szczurów kontrolnych liczba ta wynosi około 50%. Gałki oczne szczurów z DED charakteryzują się znacznie wyższym poziomem komórek T pamięci efektorowej niż gałki oczne szczurów kontrolnych. Po wykonaniu tej procedury można przeprowadzić barwienie innych rodzajów komórek odpornościowych w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania.

Przykładowo, można przeprowadzić barwienie w kierunku komórek odporności wrodzonej lub limfocytów B. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom do zrozumienia immunologii powierzchni oka, a w dalszej kolejności do badania zespołu suchego oka u ludzi oraz zespołu Sjögrena. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak indukować autoimmunologiczne suche oko u szczurów oraz jak rzetelnie dokumentować uzyskane wyniki.