Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Protokół ten pozwala na wygenerowanie dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T specyficznych dla antygenu, które są pożądanym bezpiecznym podejściem w leczeniu chorób autoimmunologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wysoce wydajny proces transdukcji i dużą liczbę funkcjonalnych limfocytów T. Technika ta może być rozszerzona na leczenie cukrzycy typu 1 i innych chorób autoimmunologicznych, w których znane są antygeny.

Co więcej, limfocyty CAR T mogą być obiecującym sposobem leczenia niektórych rodzajów raka. Metoda ta może być stosowana do generowania komórek odpornościowych wykazujących ekspresję innych CAR. Ważne jest, aby mieć dobrą, zaakceptowaną technikę, przeczytać cały protokół i zaplanować cały eksperyment z wyprzedzeniem.

Ten dwutygodniowy protokół obejmuje mini-kroki, a sukces zależy od prawidłowego wykonania każdego kroku. Wizualne demonstracje tej metody mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego naśladowania przez uczniów. Przygotuj komórki Feniksa do transfekcji zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Dobrą praktyką jest oznaczenie bocznej ściany, na której będzie dodawane i usuwane podłoże, aby zminimalizować zdmuchiwanie komórek. W dniu zerowym odessać supernatant z komórek i przemyć je pięcioma mililitrami PBS. Ostrożnie dodać kroplami siedem mililitrów zredukowanej pożywki surowicy do bocznej ścianki płytki i przenieść komórki z powrotem do inkubatora.

Dodaj 1,5 mililitra zredukowanej pożywki surowicy do dwóch 14-milimetrowych probówek polipropylenowych z okrągłym dnem. Dodać 40 mikrometrów odczynnika do transfekcji do jednej z probówek i 15 mikrogramów plazmidu CAR przekierowanego na przeciwciało wraz z pięcioma mikrogramami plazmidu pakującego do drugiej. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie dodać odczynnik do transfekcji do probówki plazmidowej.

Wymieszać, delikatnie pipetując roztwór trzy razy w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut. Dodaj trzy mililitry mieszaniny do komórek Feniksa i umieść je w inkubatorze do hodowli tkankowych. Po czterech do pięciu godzinach dodaj jeden mililitr FCS do komórek i hoduj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia usunąć supernatant z komórek i dodać cztery mililitry świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Zbierz wirusa drugiego dnia, zbierając pożywkę zawierającą wirusa z komórek Phoenix i filtrując ją w celu usunięcia resztek komórek. Dodać rekombinowany ludzki zapas IL-2 do wirusa w celu uzyskania końcowego stężenia 200 jednostek międzynarodowych na mililitr i natychmiast użyć go do transdukcji.

Dodaj cztery mililitry świeżej pożywki do komórek Phoenix i umieść je na noc w inkubatorze. Powtórz pobieranie wirusa następnego dnia w celu drugiej transdukcji i wyrzuć komórki. Dzień przed wysiewem mysich limfocytów T CD8 dodaj jeden mililitr mieszaniny przeciwciał anty-mysich CD3 i CD28 do każdego dołka 24-dołkowej płytki i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

W dniu zerowym zbierz śledziony myszy i umieść je na sitku komórkowym nasączonym 10 mililitrami PBS w naczyniu do hodowli komórkowych na lodzie. W kapturze do hodowli komórkowej pokrój każdą śledzionę na trzy do pięciu kawałków i użyj sterylnego tłoka strzykawki, aby przecisnąć tkankę przez drucianą siatkę. Delikatnie usuń czerwone krwinki, ponownie zawieszając splenocyty w jednym do czterech rozcieńczonych do lizy krwinek czerwonych i inkubując je w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie rozcieńczyć 10 mikrolitrów zawiesiny komórek błękitem trypanowym w celu zliczenia komórek.

I osadzaj resztę komórek, wirując z prędkością 350 razy g przez siedem minut. Użyj zestawu do izolacji mysich komórek T CD8, aby wzbogacić limfocyty T CD8 i zawiesić granulki komórek w 400 mikrolitrach buforu ze 100 mikrolitrami koktajlu przeciwciał biotyny na jeden razy 10 do ósmych komórek. Dobrze wymieszaj zawiesinę komórkową i inkubuj ją przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić związanie przeciwciał.

Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu do znakowania i 200 mikrolitrów mikrogranulek antybiotyny na jeden razy 10 do ósmych komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez kolejne 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W międzyczasie ustaw kolumnę separacyjną na separatorze i umyj ją trzema mililitrami buforu do etykietowania.

Umieść sitko do komórek o średnicy 40 mikrometrów na górze kolumny i przepuść jeden mililitr mieszaniny kulek i komórek przez sitko do kolumny separacyjnej. Zebrać przepływ do wstępnie schłodzonej rurki o pojemności 15 mililitrów i umyć kolumnę zgodnie ze wskazówkami producenta, zbierając ścieki do tej samej rurki. Policz komórki i zbierz je przez odwirowanie w ilości 350 razy g przez pięć minut.

Umyj je dwoma mililitrami pożywki z komórek T i ponownie odwiruj. Następnie ponownie zawieś je we wstępnie podgrzanej pożywce z limfocytów T w stężeniu od 250 000 do 500 000 komórek na mililitr. Przemyć wcześniej przygotowane płytki pokryte przeciwciałami CD3 i CD28 trzykrotnie jednym mililitrem sterylnego PBS i dodać dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdej studzienki.

Użyj ruchu wirowego, aby równomiernie dozować komórki. Jako kontrolę, umieść tę samą liczbę limfocytów T CD8 w jednym niepowlekanym dołku płytki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze ze zbiornikiem 10% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Pierwszego dnia przygotuj płytki pokryte ludzkim fragmentem fibronektyny, dodając 0,5 mililitra fibronektyny do dołków 24-dołkowej płytki i inkubując ją przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnego dnia usuń roztwór fibronektyny i dodaj jeden mililitr 2% BSA i PBS na studzienkę. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut i umyć poddane działaniu środka studzienki jednym mililitrem sterylnego PBS. Płytka jest gotowa do użycia po usunięciu roztworu myjącego.

Policz aktywowane limfocyty T CD8 za pomocą błękitu trypanowego. Zbierz je przez odwirowanie. I ponownie zawiesić je na poziomie pięciu milionów żywotnych komórek na mililitr w celu transdukcji.

Dodaj 100 mikrolitrów aktywowanej zawiesiny komórek CD8 do każdej studzienki płytki pokrytej fibronektyną. Następnie dodaj 1,5 do dwóch mililitrów wcześniej przygotowanej pożywki zawierającej wirusa i wymieszaj ruchem wirowym, aby równomiernie dozować komórki. Zamknij płytkę w woreczku Ziploc i odwiruj ją w temperaturze 2 000 g przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wyjmij płytkę z wirówki i przenieś ją do komory bezpieczeństwa biologicznego. Ostrożnie wyjmij plastikową torbę i upewnij się, że zewnętrzna strona płytki nie jest zanieczyszczona podłożem. Przenieś płytkę do inkubatora dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po czterech godzinach usuń jeden mililitr pożywki z każdej studzienki, zastąp ją jednym mililitrem wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki z komórek T i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze. Krytycznymi aspektami tego protokołu są wirus o wysokim mianie, zdrowe aktywowane limfocyty T i odpowiednia metoda transdukcji. Komórki barwiono współczynnikiem anty-CD8 sprzężonym z rozmiarem PE siedmiu, sprzężonym anty-CD3 AF647 i anty-CD28 sprzężonym BV 421 do analizy cytometrii przepływowej.

Około 70% limfocytów T CD8 ulega koekspresji GFP, co wskazuje na ekspresję CAR. Ulegli również jednoczesnej ekspresji CD28 i CD3. Co ważne, wszystkie testowane komórki GFP były również współbarwione tetramerami insuliny BR3 I-Ag7, co wskazuje na ekspresję CAR na powierzchni komórki, ale nie tetramerem kontrolnym.

Co więcej, posortowane limfocyty CAR T testowe i kontrolne wydzielały wysoki poziom interferonu gamma dopiero po kohodowli z komórkami docelowymi wyrażającymi swoje pokrewne ligandy, co potwierdza, że transdukowane komórki mają fenotyp limfocytów T efektorowych CD8 skierowany w kierunku celu przeciwciał macierzystych. Transdukcja komórek wytwarzających wirusa, izolacja pierwotnych limfocytów T CD8 i aktywacja tych limfocytów T są najważniejszymi etapami tego eksperymentu. Posiadanie zdrowych aktywowanych limfocytów T i transdukcja tych limfocytów T odpowiednimi odczynnikami zapewnia korzystne wyniki.

Ta metoda może być stosowana do transdukcji innych limfocytów T, ale musi być dostosowana do określonego typu limfocytów T. Protokół ten toruje drogę do zapobiegania cukrzycy typu 1 za pomocą terapii limfocytami T z receptorem chimerycznego antygenu