Name: Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj metodę wysokowydajnej transdukcji do generowania funkcjonalnych limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu myszy. Protokół umożliwia badania w autoimmunologicznym modelu cukrzycy typu 1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez granty JDRF 1-INO-2015-74-S-B, 2--2016-238-S-B i-2-S-2018-648-S-B, Diabetes Education and Action Award, oraz Caroline Wiess Law Fund for Research in Molecular Medicine w Baylor College of Medicine. Sortowanie komórek było wspierane przez Cytometry and Cell Sorting Core w Baylor College of Medicine z finansowaniem z NIH (S10RR024574 i P30CA125123). Wszystkie tetramery peptydowe-MHC uzyskano z NIH Tetramer Core Facility.

<ol><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li>
<li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove%3A+theory+becomes+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li>
<li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li>
<li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4%2B+T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+%28NOD%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li>
<li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected%2C+weak+binding+register%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II%3Apeptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li>
<li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li>
<li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li>
<li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li>
<li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor. N.Y. (1982).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnstone%2C+A+%22Immunochemistry+in+practice%22">Immunochemistry in practice</a>. , 3rd edn, Blackwell Science. Cambridge, MA. (1996).</li>
<li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRowland-Jones%2C+SL+%22Lymphocytes%3A+a+practical+approach%22">Lymphocytes: a practical approach</a>. , 2nd ed, Practical approach series. New York. (2000).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li>
<li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li>
<li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701(2013).</li>
<li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li>
<li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li>
<li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li>
<li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li>
<li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+%28DELFIA%29+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunoassay+%26+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li>
</ol>

MAb287 i jego pochodne są chronione amerykańskim patentem wydanym w 2014 roku.

Protokół ten opisuje skuteczną metodę wytwarzania specyficznych dla antygenu komórek CD8 CAR-T poprzez transdukcję retrowirusową. Wydajność transdukcji naszego protokołu jest zazwyczaj wysoka i ogólnie obserwuje się solidną ekspresję CAR. Rozszerzone limfocyty CAR T zachowują podstawowe cechy limfocytów T aktywowanych przez rodziców oraz swoistość przeciwciał i nadają się zarówno do stosowania in vitro, jak i in vivo. Zastosowaliśmy limfocyty T Ab-CAR CD8 w przeprogramowaniu cukrzycy typu 1 u myszy NOD7...

Biorąc pod uwagę prawdopodobne zmniejszone ryzyko wystąpienia niepożądanych efektów, terapie immunologiczne specyficzne dla antygenu (ASI) są obiecującymi metodami leczenia chorób autoimmunologicznych, takich jak T1D. Coraz więcej dowodów sugeruje, że odpowiedź immunologiczna na (pre)insulinę może być szczególnie ważna w cukrzycy typu 1D1. W ciągu ostatniej dekady badania przeprowadzone w wielu grupach, w tym w naszym, zdecydowanie sugerują, że prezentacja epitopu zawierającego aminokwasy łańcucha B insuliny od 9 do 23 przez specyficzne cząsteczki MHC klasy II (B:9-23/MHCII), odgrywa ważną rolę w rozwoju T1D u myszy i ludzi2,3,4,5. Aby selektywnie celować w kompleks B: 9-23 / MHCII, wygenerowaliśmy przeciwciało monoklonalne o nazwie mAb287, które nie ma reaktywności krzyżowej z hormonem insuliną lub kompleksami zawierającymi inne peptydy6. MAb287 blokuje prezentację antygenu in vitro, a cotygodniowe podawanie mAb287 myszom NOD ze stanem przedcukrzycowym opóźniało rozwój T1D u 35% leczonych myszy 6. Aby zablokować prezentację antygenu in vivo, zwykle wymagane są częste wstrzyknięcia w celu utrzymania wysokiego stężenia we krwi. Postawiliśmy hipotezę, że możemy przezwyciężyć tę trudność, wykorzystując wysoką specyficzność Ab287 do przeprogramowania limfocytów T, zapewniając w ten sposób ulepszoną terapię limfocytami T specyficznymi dla antygenu dla T1D7.
Cytotoksyczne limfocyty T są w stanie zabić swój cel, jeśli nawet jedna kopia ich pokrewnego liganda zostanie wyrażona8,9,10. W związku z tym oczekuje się, że limfocyty T CD8 specyficzne dla B: 9-23 / MHCII będą miały wyższą skuteczność w eliminowaniu niepożądanej prezentacji antygenu niż przeciwciało macierzyste, które prawdopodobnie będzie musiało związać się z wieloma kompleksami na tym samym APC, aby wywrzeć swój efekt. Limfocyty CAR T były używane w leczeniu wielu nowotworów u ludzi11,12,13, i mogą być również skuteczne w autoimmunizacji14. Jednak komórki CAR-T ze swoistością dla patogennych kompleksów peptyd-MHC nie były do tej pory wykorzystywane do modyfikowania progresji T1D. Korzystając ze zoptymalizowanej techniki transdukcji limfocytów T CD8 opisanej poniżej, niedawno wykazaliśmy dowód na zasadę, że jest to rzeczywiście realne podejście7.
W tym protokole przedstawiamy efektywną i uproszczoną metodę transdukcji i ekspansji. Nasz protokół ma zastosowanie w innych badaniach wymagających generacji mysich limfocytów CD8 CAR T o wysokiej wydajności.

<table><tbody><tr><td>2-merkaptoetanol (50mM)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>50 &mu; M</td></tr><tr><td>5' RACE PCR</td><td>Clontech</td><td>634859</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciała anty-mysie CD28</td><td>eBioscience</td><td>14-0281-86</td><td>końcowe stężenie przy 1&mikro; g/ml</td></tr><tr><td>przeciwciało anty-mysie CD3e</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>końcowe stężenie przy 1&mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Biotyna Szczur Anty-Mysz IFN-&gamma;</td><td>BD Biosciences</td><td>554410</td><td>Stężenie robocze przy 0,5 &mikro; g/ml</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Maxi-Prep bez endo-free</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>Final 50 &micro; g/ml.</td></tr><tr><td>Inaktywowany termicznie</td><td>Hyklon</td> FCS <td>SH30087.03</td><td>Final 10% FCS</td></tr><tr><td>HEPES (100X)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>1X</td></tr><tr><td>IAg7-CLIP tetramer-BV421</td><td>Tetramer NIH Zakład w Emory</td><td>za zatwierdzenie</td><td>Stężenie robocze przy 6 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>IAg7-insulina P8E tetramer-BV421</td><td>Tetramer NIH Zakład w Emory</td><td>za zatwierdzenie</td><td>Stężenie robocze przy 6 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Insulina-Transferyna-Selen-Etanoloamina (ITS 100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>51500056</td><td>Końcowe stężenie to 1x</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Bufor separacyjny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek T CD8a+ myszy</td><td>Miletenyi Biotec Inc</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do izolacji komórek T CD8a+ myszy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (5000U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15070063</td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td>Komórki Phoenix-ECO</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>pMIG II</td><td>Addgene</td><td>52107</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-IRES-GFP II</td><td>Addgene</td><td>52107</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczony szczur Anti-Mouse IFN-&gamma;</td><td>BD Biosciences</td><td>551216</td><td>Stężenie robocze przy 3 &mikro; g / ml</td></tr><tr><td>Bufor do lizy krwinek czerwonych</td><td>Sigma</td><td>R7767</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin</td><td>Takara</td><td>T100A</td><td>Stężenie robocze przy 50 &mikro; g/ml w PBS</td></tr><tr><td>rhIL-2 (stężenie podstawowe 105 IU/ul)</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td>Stężenie końcowe przy 200 IU/ml</td></tr><tr><td>rmIL-7 (stężenie podstawowe 50ng/ul)</td><td>R& D</td><td>407-ML-005</td><td>Końcowe stężenie przy 0,5 ng / ml</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne sitka komórkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Tryple</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr></tbody></table>

wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów t myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Cukrzyca typu 1 (T1D) charakteryzuje się autoimmunizacją specyficzną dla wysp trzustkowych, prowadzącą do niszczenia komórek beta i absolutnej utraty produkcji insuliny. W mysim modelu spontanicznej cukrzycy nieotyłej (NOD) insulina jest głównym celem, a manipulacja genetyczna tych zwierząt w celu usunięcia jednego kluczowego epitopu insuliny zapobiega chorobie. Tak więc selektywna eliminacja profesjonalnych komórek prezentujących antygen (APC) zawierających ten patogenny epitop jest podejściem do hamowania niepożądanych odpowiedzi autoimmunologicznych specyficznych dla insuliny i prawdopodobnie ma większy potencjał translacyjny.
Chimeryczne receptory antygenowe (CAR) mogą przekierowywać limfocyty T do selektywnego celowania w chorobotwórcze antygeny. Technika ta ma fundamentalne znaczenie dla ostatnich prób wykorzystania inżynierii komórkowej w adoptywnej terapii komórkowej w leczeniu wielu nowotworów. W tym protokole opisujemy zoptymalizowany protokół transdukcji retrowirusa limfocytów T (RV) i ekspansji in vitro, który generuje dużą liczbę funkcjonalnych komórek CAR-T CD8 specyficznych dla antygenu, zaczynając od niewielkiej liczby komórek naiwnych. Wcześniej opisano wiele protokołów komórkowych CAR-T, ale zazwyczaj ze stosunkowo niską wydajnością transdukcji i żywotnością komórek po transdukcji. W przeciwieństwie do tego, nasz protokół zapewnia do 90% skuteczności transdukcji, a wygenerowane komórki mogą przetrwać ponad dwa tygodnie in vivo i znacznie opóźnić początek choroby po pojedynczej infuzji. Zapewniamy szczegółowy opis protokołu konserwacji i transdukcji komórek, aby można było łatwo wykonać krytyczne kroki. Całą procedurę od pierwotnej izolacji komórek do ekspresji CAR można przeprowadzić w ciągu 14 dni. Ogólna metoda może być zastosowana do każdego modelu choroby myszy, w którym znany jest cel. Podobnie, specyficzne zastosowanie (ukierunkowane na patogenny peptyd/kompleks MHC klasy II) ma zastosowanie do każdego innego modelu choroby autoimmunologicznej, dla którego zidentyfikowano kluczowy kompleks.

Zazwyczaj wydajność transdukcji przy zastosowaniu tego protokołu wynosi ~60-90%. W eksperymencie przedstawionym na Rysunku 3, przed sortowaniem około 70% limfocytów T CD8 wykazywało koekspresję GFP. Wykazywały one również koekspresję CD28 oraz CD3 (Rysunek 3C). Co istotne, wszystkie „testowe” komórki GFP+ były również dodatnie w barwieniu z tetramerami IAg7-B:R3, ale nie z tetramerem kontrolnym (<strong clas...

Ten artykuł opisuje protokół generowania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 i ich ekspansji in vitro, w celu uzyskania dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T do użycia in vitro i in vivo.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Protokół ten pozwala na wygenerowanie dużej liczby funkcjonalnych limfocytów T specyficznych dla antygenu, które są pożądanym bezpiecznym podejściem w leczeniu chorób autoimmunologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia ona wysoce wydajny proces transdukcji i dużą liczbę funkcjonalnych limfocytów T. Technika ta może być rozszerzona na leczenie cukrzycy typu 1 i innych chorób autoimmunologicznych, w których znane są antygeny.Co więcej, limfocyty CAR T mogą być obiecującym sposobem leczenia niektórych rodzajów raka. Metoda ta może być stosowana do generowania komórek odpornościowych wykazujących ekspresję innych CAR. Ważne jest, aby mieć dobrą, zaakceptowaną technikę, przeczytać cały protokół i zaplanować cały eksperyment z wyprzedzeniem.Ten dwutygodniowy protokół obejmuje mini-kroki, a sukces zależy od prawidłowego wykonania każdego kroku. Wizualne demonstracje tej metody mają kluczowe znaczenie dla prawidłowego naśladowania przez uczniów. Przygotuj komórki Feniksa do transfekcji zgodnie z opisem w manuskrypcie.Dobrą praktyką jest oznaczenie bocznej ściany, na której będzie dodawane i usuwane podłoże, aby zminimalizować zdmuchiwanie komórek. W dniu zerowym odessać supernatant z komórek i przemyć je pięcioma mililitrami PBS. Ostrożnie dodać kroplami siedem mililitrów zredukowanej pożywki surowicy do bocznej ścianki płytki i przenieść komórki z powrotem do inkubatora.Dodaj 1,5 mililitra zredukowanej pożywki surowicy do dwóch 14-milimetrowych probówek polipropylenowych z okrągłym dnem. Dodać 40 mikrometrów odczynnika do transfekcji do jednej z probówek i 15 mikrogramów plazmidu CAR przekierowanego na przeciwciało wraz z pięcioma mikrogramami plazmidu pakującego do drugiej. Inkubować probówki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie dodać odczynnik do transfekcji do probówki plazmidowej.Wymieszać, delikatnie pipetując roztwór trzy razy w górę i w dół, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 20 minut. Dodaj trzy mililitry mieszaniny do komórek Feniksa i umieść je w inkubatorze do hodowli tkankowych. Po czterech do pięciu godzinach dodaj jeden mililitr FCS do komórek i hoduj je przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnego dnia usunąć supernatant z komórek i dodać cztery mililitry świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej. Zbierz wirusa drugiego dnia, zbierając pożywkę zawierającą wirusa z komórek Phoenix i filtrując ją w celu usunięcia resztek komórek. Dodać rekombinowany ludzki zapas IL-2 do wirusa w celu uzyskania końcowego stężenia 200 jednostek międzynarodowych na mililitr i natychmiast użyć go do transdukcji.Dodaj cztery mililitry świeżej pożywki do komórek Phoenix i umieść je na noc w inkubatorze. Powtórz pobieranie wirusa następnego dnia w celu drugiej transdukcji i wyrzuć komórki. Dzień przed wysiewem mysich limfocytów T CD8 dodaj jeden mililitr mieszaniny przeciwciał anty-mysich CD3 i CD28 do każdego dołka 24-dołkowej płytki i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.W dniu zerowym zbierz śledziony myszy i umieść je na sitku komórkowym nasączonym 10 mililitrami PBS w naczyniu do hodowli komórkowych na lodzie. W kapturze do hodowli komórkowej pokrój każdą śledzionę na trzy do pięciu kawałków i użyj sterylnego tłoka strzykawki, aby przecisnąć tkankę przez drucianą siatkę. Delikatnie usuń czerwone krwinki, ponownie zawieszając splenocyty w jednym do czterech rozcieńczonych do lizy krwinek czerwonych i inkubując je w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie rozcieńczyć 10 mikrolitrów zawiesiny komórek błękitem trypanowym w celu zliczenia komórek.I osadzaj resztę komórek, wirując z prędkością 350 razy g przez siedem minut. Użyj zestawu do izolacji mysich komórek T CD8, aby wzbogacić limfocyty T CD8 i zawiesić granulki komórek w 400 mikrolitrach buforu ze 100 mikrolitrami koktajlu przeciwciał biotyny na jeden razy 10 do ósmych komórek. Dobrze wymieszaj zawiesinę komórkową i inkubuj ją przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umożliwić związanie przeciwciał.Następnie dodaj 300 mikrolitrów buforu do znakowania i 200 mikrolitrów mikrogranulek antybiotyny na jeden razy 10 do ósmych komórek. Dobrze wymieszaj i inkubuj przez kolejne 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W międzyczasie ustaw kolumnę separacyjną na separatorze i umyj ją trzema mililitrami buforu do etykietowania.Umieść sitko do komórek o średnicy 40 mikrometrów na górze kolumny i przepuść jeden mililitr mieszaniny kulek i komórek przez sitko do kolumny separacyjnej. Zebrać przepływ do wstępnie schłodzonej rurki o pojemności 15 mililitrów i umyć kolumnę zgodnie ze wskazówkami producenta, zbierając ścieki do tej samej rurki. Policz komórki i zbierz je przez odwirowanie w ilości 350 razy g przez pięć minut.Umyj je dwoma mililitrami pożywki z komórek T i ponownie odwiruj. Następnie ponownie zawieś je we wstępnie podgrzanej pożywce z limfocytów T w stężeniu od 250 000 do 500 000 komórek na mililitr. Przemyć wcześniej przygotowane płytki pokryte przeciwciałami CD3 i CD28 trzykrotnie jednym mililitrem sterylnego PBS i dodać dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdej studzienki.Użyj ruchu wirowego, aby równomiernie dozować komórki. Jako kontrolę, umieść tę samą liczbę limfocytów T CD8 w jednym niepowlekanym dołku płytki i inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze ze zbiornikiem 10% dwutlenku węgla przez 48 godzin. Pierwszego dnia przygotuj płytki pokryte ludzkim fragmentem fibronektyny, dodając 0,5 mililitra fibronektyny do dołków 24-dołkowej płytki i inkubując ją przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Następnego dnia usuń roztwór fibronektyny i dodaj jeden mililitr 2% BSA i PBS na studzienkę. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 30 minut i umyć poddane działaniu środka studzienki jednym mililitrem sterylnego PBS. Płytka jest gotowa do użycia po usunięciu roztworu myjącego.Policz aktywowane limfocyty T CD8 za pomocą błękitu trypanowego. Zbierz je przez odwirowanie. I ponownie zawiesić je na poziomie pięciu milionów żywotnych komórek na mililitr w celu transdukcji.Dodaj 100 mikrolitrów aktywowanej zawiesiny komórek CD8 do każdej studzienki płytki pokrytej fibronektyną. Następnie dodaj 1,5 do dwóch mililitrów wcześniej przygotowanej pożywki zawierającej wirusa i wymieszaj ruchem wirowym, aby równomiernie dozować komórki. Zamknij płytkę w woreczku Ziploc i odwiruj ją w temperaturze 2 000 g przez 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wyjmij płytkę z wirówki i przenieś ją do komory bezpieczeństwa biologicznego. Ostrożnie wyjmij plastikową torbę i upewnij się, że zewnętrzna strona płytki nie jest zanieczyszczona podłożem. Przenieś płytkę do inkubatora dwutlenku węgla o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Po czterech godzinach usuń jeden mililitr pożywki z każdej studzienki, zastąp ją jednym mililitrem wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki z komórek T i umieść płytkę z powrotem w inkubatorze. Krytycznymi aspektami tego protokołu są wirus o wysokim mianie, zdrowe aktywowane limfocyty T i odpowiednia metoda transdukcji. Komórki barwiono współczynnikiem anty-CD8 sprzężonym z rozmiarem PE siedmiu, sprzężonym anty-CD3 AF647 i anty-CD28 sprzężonym BV 421 do analizy cytometrii przepływowej.Około 70% limfocytów T CD8 ulega koekspresji GFP, co wskazuje na ekspresję CAR. Ulegli również jednoczesnej ekspresji CD28 i CD3. Co ważne, wszystkie testowane komórki GFP były również współbarwione tetramerami insuliny BR3 I-Ag7, co wskazuje na ekspresję CAR na powierzchni komórki, ale nie tetramerem kontrolnym.Co więcej, posortowane limfocyty CAR T testowe i kontrolne wydzielały wysoki poziom interferonu gamma dopiero po kohodowli z komórkami docelowymi wyrażającymi swoje pokrewne ligandy, co potwierdza, że transdukowane komórki mają fenotyp limfocytów T efektorowych CD8 skierowany w kierunku celu przeciwciał macierzystych. Transdukcja komórek wytwarzających wirusa, izolacja pierwotnych limfocytów T CD8 i aktywacja tych limfocytów T są najważniejszymi etapami tego eksperymentu. Posiadanie zdrowych aktywowanych limfocytów T i transdukcja tych limfocytów T odpowiednimi odczynnikami zapewnia korzystne wyniki.Ta metoda może być stosowana do transdukcji innych limfocytów T, ale musi być dostosowana do określonego typu limfocytów T. Protokół ten toruje drogę do zapobiegania cukrzycy typu 1 za pomocą terapii limfocytami T z receptorem chimerycznego antygenu specyficznego dla antygenu.

high-efficiency-generation-antigen-specific-primary-mouse-cytotoxic-t

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Testy limfocytotoksyczności komórkowej (CML) mogą być wykorzystywane do badania odpowiedzi autoreaktywnych oraz mechanizmów śmierci komórek in vitro. Jednak dzięki zastosowaniu technik obrazowania konfokalnego żywych komórek z użyciem barwników fluorescencyjnych, typ i kinetyka śmierci komórkowej, a także wykorzystywane szlaki, mogą być badane w znacznie większych szczegółach.

Metody oceny śmierci komórek beta pośredniczonej przez cytotoksyczne limfocyty T

Opisano prosty protokół przygotowania ekstraktów z ludzkich tkanek, które służą jako źródło antygenów w funkcjonalnych testach limfocytów T. Metoda ta pozwala na pomiar odpowiedzi limfocytów T na antygeny pochodzące z tkanek in vitro.

Ekstrakcja antygenów tkankowych do analiz funkcjonalnych

Film prezentuje test oparty na cytometrii przepływowej do oznaczania dominacji immunologicznej w cytotoksycznych limfocytach T lub odpowiedziach CTL. Wstrzyknięte fluorescencyjne komórki docelowe wykazują różną fluorescencję odpowiadającą epitopom immunogennym. Pobranie i sortowanie po śledzionie ujawnia zmniejszenie liczby komórek fluorescencyjnych o wysokiej intensywności, co potwierdza dominację immunologiczną w odpowiedziach CTL.

Test do oceny immunodominacji w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T

Ten film demonstruje technikę generowania limfocytów T z chemerycznym receptorem antygenu (CAR) specyficznym dla antygenu poprzez transdukcję retrowirusową. Aktywowane mysie limfocyty T CD8 + dodaje się do płytki mikrodołkowej pokrytej rekombinowanymi fragmentami fibronektyny. Następnie wprowadza się wektory retrowirusowe zawierające transgeniczne RNA kodujące specyficzny dla antygenu chimeryczny receptor antygenowy (CAR), a płytkę odwirowuje się w celu ułatwienia transdukcji. Po inkubacji...

Technika wytwarzania limfocytów CAR T specyficznych dla antygenu

Ten film demonstruje metodę opartą na obrazowaniu, aby zwizualizować przeszczepione komórki beta z ekspresją lucyferazy do nieotyłej myszy z cukrzycą z niedoborem odporności. Wprowadzenie splenocytów od myszy z cukrzycą prowadzi do postępującego niszczenia komórek beta, co jest wizualnie potwierdzone spadkiem luminescencji po wprowadzeniu substratu.

Obrazowanie transgenicznych komórek beta u myszy z niedoborem odporności i prowokacją ze splenocytami cukrzycowymi

Zapewniamy powtarzalną metodę wywoływania cukrzycy typu 1 (T1D) u myszy w ciągu dwóch tygodni poprzez adopcyjny transfer pierwotnych limfocytów T CD4+ specyficznych dla antygenu wysp trzustkowych.

Przyspieszona indukcja cukrzycy typu 1 u myszy przez adoptywny transfer cukrzycowych limfocytów T CD4 +

Prezentujemy tutaj metodę rozwoju funkcjonalnych limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu (Ag) (Treg) z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) do immunoterapii autoimmunologicznego zapalenia stawów w modelu mysim.

Rozwój limfocytów T regulatorowych specyficznych dla antygenu macierzystego przeciwko autoimmunizacji

Opisano przygotowanie antygenowych nanocząsteczek liposomalnych i ich zastosowanie w stymulowaniu aktywacji komórek B in vitro i in vivo. Spójne i silne odpowiedzi przeciwciał doprowadziły do opracowania nowego modelu alergii na orzeszki ziemne. Protokół generowania liposomów antygenowych można rozszerzyć na różne antygeny i modele immunizacji.

Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

Ten protokół opisuje chirurgiczne generowanie ortotopowych guzów trzustki i szybkie trawienie świeżo wyizolowanych mysich guzów trzustki. Po trawieniu żywotne populacje komórek odpornościowych można wykorzystać do dalszej analizy, w tym stymulacji ex vivo limfocytów T do wewnątrzkomórkowego wykrywania cytokin za pomocą cytometrii przepływowej.

Generowanie ortotopowych guzów trzustki i charakterystyka ex vivo cytotoksyczności limfocytów T naciekających nowotwór

Ten protokół opisuje prostą i minimalnie inwazyjną metodę przeszczepiania i obrazowania komórek NIT-1 u myszy z nieotyłym cukrzycą (NOD) z ciężkim niedoborem odporności, którym podano splenocyty oczyszczone z myszy NOD z spontaniczną cukrzycą.

Bioluminescencyjne monitorowanie przeżywalności przeszczepu w adoptywnym modelu transferowym cukrzycy autoimmunologicznej u myszy

Poznaj metodę wysokowydajnej transdukcji do generowania funkcjonalnych limfocytów T CD8 specyficznych dla antygenu myszy. Protokół umożliwia badania w autoimmunologicznym modelu cukrzycy typu 1.

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy (Wideo) | JoVE Journal

Wysokowydajne wytwarzanie pierwotnych cytotoksycznych limfocytów T myszy specyficznych dla antygenu do testów funkcjonalnych w autoimmunologicznym modelu cukrzycy

Przeglądaj więcej filmów