Bedingte Knockdown von Genexpression in Krebs-Zell-Linien, die Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung zu studieren

Die Gesamtkonzeption dieses Protokolls besteht darin, den bedingten Knockdown der Genexpression in Krebszellen zu nutzen, um die Rekrutierung von Monozyten und Makrophagen in die Tumormikroumgebung in vitro zu untersuchen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Tumormikroumgebung zu beantworten, die sich auf die Art der Kreuzung zwischen den Krebszellen und den Zellen des Immunsystems beziehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das hier verwendete System die Klonierung einzelner Vektoren erfordert, eine schnelle Erzeugung mehrerer Klone ermöglicht und eine sehr geringe Dicke aufweist.

Ebenfalls demonstriert wird ein Verfahren zur Aufreinigung menschlicher Monozyten ohne direkten Kontakt mit Antikörpern, das eine versehentliche Aktivierung vermeidet und gleichzeitig zu einer Reinheit von mehr als 95 % menschlicher Monozyten führt. Um Viruspartikel herzustellen, transfizieren Sie 70 % konfluente 150-Millimeter-Schalen von HEK-293-Zellen mit 25 Mikrogramm pLKO-tet-on-shRNA, 25 Mikrogramm des psPAX-Verpackungsplasmids und fünf Mikrogramm des Hüll-exprimierenden Plasmids pMD2. G unter Verwendung eines Transfektionsreagenzes gemäß Standardprotokollen.

Die Mischung in die 150-Millimeter-Schalen geben. Induzieren Sie am nächsten Tag die lentivirale Produktion in den Zellen, indem Sie das Medium auf DMEM umstellen, das mit 10 Millimolar Natriumbutyrat und 20 Millimolar HEPES ergänzt wird. Acht Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid kultivieren.

Waschen Sie die Zellen nach acht Stunden mit PBS und fügen Sie 25 Milliliter frisches DMEM-Medium mit 20 millimolaren HEPES und ohne Natriumbutyrat hinzu. Nach einer Inkubation von 48 Stunden ist das virushaltige Medium vorsichtig mit einer Pipette zu sammeln. Um stabile Zelllinien zu erzeugen, beginnen Sie mit der Aussaat von HCT-116-Dickdarmkrebszellen und MDA-MB-231-Brustkrebszellen in eine 12-Well-Platte und 50.000 Zellen pro Well.

Inkubieren bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Wenn die Zellen zu 60-70 % konfluent sind, waschen Sie die Zellen mit PBS und geben Sie einen Milliliter virushaltiges Medium in jede Vertiefung. Entfernen Sie am nächsten Tag das virushaltige Medium vorsichtig durch Aspiration.

Nachdem Sie die Zellen mit PBS gewaschen haben, fügen Sie Medium hinzu, das Tetracyclin-freies FBS enthält. Nach 72 Stunden waschen Sie die Zellen wie zuvor und fügen Sie Medium hinzu, das mit einem Mikrogramm pro Milliliter Puromycin für die Selektion der virustransfizierten Zellen ergänzt ist. Wählen Sie virustransduzierte Zellen aus, indem Sie Zellen in Gegenwart von Puromycin drei bis 14 Tage lang kultivieren.

Beobachten Sie eine teilweise Abtötung der Vertiefungen durch Puromycin in den Zellen mit virustransduzierten Zellen. Nicht transduzierte Zellen wachsen in Gegenwart von Puromycin nicht. Wenn diese Kontrollzellen abgestorben sind, setzen Sie die Kultivierung der bedingt regulierten Zelllinien für zwei Wochen in Gegenwart von Antibiotika fort, um die bedingt regulierten Zelllinien zu erzeugen.

Überprüfen Sie die Wirksamkeit des bedingten Knockdowns in den Puromycin-resistenten HCT-116-Dickdarmkrebs- und MDA-MB-231-Brustkrebszellen, indem Sie Medium mit unterschiedlichen Konzentrationen von Doxycyclin hinzufügen und die Zellen 72 Stunden lang kultivieren. Nach der Herstellung des Zelllysats ist der Grad des Knockdowns durch Western-Blot-Analyse zu überprüfen. Hier sind die Pegel von PAI-1 dargestellt.

Um Monozyten aus peripherem Blut zu isolieren, bereiten Sie zunächst drei 50-Milliliter-Röhrchen mit 15 Millilitern Dichtegradientenlösung vor. Verwenden Sie dann eine Pipettensteuerung, die auf Gravitationsfluss eingestellt ist, um langsam 30 Milliliter verdünntes Blut über die Dichtegradientenlösung zu schichten. Im Ausschwingrotor bei 400 g bei Raumtemperatur ohne Unterbrechung 25 Minuten zentrifugieren.

Nach der Zentrifugation entsorgen Sie die oberste Schicht und übertragen die mittlere Schicht mit mononukleären Zellen des peripheren Blutes in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie FBS-ergänztes PBS bis zu 50 Milliliter hinzu. Bei 120 g bei Raumtemperatur 10 Minuten zentrifugieren. Entfernen Sie nach dem Schleudern den enthaltenden plättchenhaltigen Überstand.

Nach der abschließenden Zentrifugation und Entnahme wird das Pellet in 50 Millilitern FBS-supplementiertem PBS resuspendiert und die mononukleären Zellen des peripheren Blutes mit einem Hämozytometer gezählt. Nachdem Sie die Zellen bei 120 g zentrifugiert haben, resuspendieren Sie das Pellet in FBS-supplementiertem PBS, das ein millimolares EDTA enthält, auf eine Endkonzentration von 50 Millionen Zellen pro Milliliter. Beginnen Sie dann mit der Anreicherung für Monozyten, indem Sie 50 Mikroliter Antikörpercocktail mit negativer Selektion pro Milliliter Zellsuspension hinzufügen und mischen.

10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach der Inkubation 50 Mikroliter magnetische Kügelchen pro Milliliter hinzufügen, mischen und weitere 10 Minuten inkubieren. Fügen Sie dann PBS mit FBS und EDTA bis zu 25 Milliliter hinzu und geben Sie das mononukleäre Gemisch aus dem peripheren Blut in einen Magneten, der ein 50-Milliliter-Röhrchen aufnehmen kann.

Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur haften die magnetischen Kügelchen an den Wänden des Röhrchens und sequestrieren die nicht-monozytären Zellen aus der Lösung. Verwenden Sie eine 25-Milliliter-Pipette, um eine monozytenhaltige Lösung aus dem Röhrchen zu entfernen, und achten Sie darauf, die Seiten des Röhrchens nicht mit der Pipette zu berühren. Nach dem Zentrifugieren und Entfernen des Überstands ist das monozytenhaltige Pellet in einem RPMI-Medium mit 10 % TET-freiem FBS und 1 % Pen-Streptokokken zu resuspendieren.

Beginnen Sie den Assay mit der Aussaat von 40.000 HCT-116- oder MDA-MB-231-Zellen in einem Volumen von 0,5 Millilitern in den Wells einer 24-Well-Platte in dreifacher Ausfertigung. Fügen Sie am nächsten Tag einen Filter zum Brunnen hinzu. Dann werden 8.000 Monozyten mit einem Volumen von 0,3 Millilitern auf einen BSA-behandelten porösen Membraneinsatz aufgebracht, der auf der Oberseite der Krebszellen platziert wird, und bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert.

Sammeln Sie die Beilagen nach 48 Stunden. Schütteln Sie das überschüssige Medium ab und wischen Sie mit einem Applikator mit Wattespitze präzise über die Innenfläche, um Zellen zu entfernen, die nicht migriert sind. Färben Sie die Außenseite des Einsatzes mit der Wright-Giemsa-Methode.

Nachdem Sie die Filter mit den migrierten Makrophagen nach oben montiert haben, bilden Sie die Objektträger mit einem Lichtmikroskop mit einem Objektiv mit 20 Potenzen ab. Fotografieren Sie neun Felder pro Filter und zählen Sie migrierte Makrophagen in allen Feldern. Der Boyden Chamber Assay wurde verwendet, um die Migration von Monozyten zu Krebszellen zu quantifizieren.

In Gegenwart von MDA-MB-231-Brustkrebszellen wurde die Migration von Monozyten um 33% gehemmt, nachdem Doxycyclin zur Co-Kultur hinzugefügt wurde, um PAI-1 herunterzuregulieren. Diese Hemmung der Monozytenmigration war in Gegenwart von HCT-116-Dickdarmkrebszellen ausgeprägter, wo der Knockdown von PAI-1 durch Doxycyclin-Verabreichung die Monozytenmigration um 74% reduzierte. Ähnliche Ergebnisse wurden beobachtet, wenn das Medium für Doxycyclin-behandelte Krebszellen als Quelle für Chemolockstoffe in den Boden der Vertiefungen gegeben wurde. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein funktionelles Tet-On-System für den Genexpressions-Knockdown in menschlichen Krebszelllinien verwenden können, um die chemoattraktive Wirkung des aus Krebs gewonnenen sekretierten Proteins PAI-1 auf die menschlichen Monozyten zu untersuchen.