Cellule des épreuves d’agrégation pour évaluer la liaison de l’encoche de la drosophile avec Trans-Ligands et son Inhibition par Cis-Ligands

L’objectif global de ce test d’agrégation est d’évaluer la liaison du récepteur Notch avec les trans-ligands et son inhibition par les ligands cis. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé : comment un facteur génétique ou pharmacologique affectera-t-il la liaison du récepteur Notch à son ligand et modifiera-t-il la signalisation ? Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’évaluer la liaison trans et cis du récepteur Notch avec son ligand.

Fait intéressant, sans impliquer l’effet de chevauchement des ligands endogènes. Commencez l’évaluation en faisant tourner les cellules réceptrices de signaux et en les remettant en suspension dans le milieu de Schneider. Comptez les cellules manuellement à l’aide d’un hémacytomètre.

Plaquez cinq fois 10 à la cinquième puissance S2 et des cellules stables S2-Notch dans chaque puits d’une plaque à six puits, dans un millilitre par puits de milieu de Schneider. Ensuite, ajoutez 7,5 microgrammes d’ARN double brin dans chaque puits et incubez les cellules à 25 degrés Celsius pendant 24 heures. Ajoutez 0,7 millimolaire de sulfate de cuivre pour induire l’expression de Notch, et incubez les cellules à 25 degrés Celsius pendant trois jours.

Après l’incubation, comptez manuellement les cellules émettrices de signaux à l’aide d’un hémacytomètre. Et plaque cinq fois 10 à la sixième cellules stables dans chaque puits d’une plaque à six puits, dans un millilitre par puits de milieu de Schneider complété. Ajoutez ensuite 0,7 millimolaire de sulfate de cuivre pour induire l’expression des ligands, et incubez les cellules à 25 degrés Celsius pendant trois heures.

Récoltez les cellules S2-control et S2-Notch traitées à l’ARN double brin par pipetage doux. Et plaque 2,5 fois 10 puissance cinquième cellules par puits dans une plaque à 24 puits. Ajoutez cinq fois 10 à la cinquième cellule de tomate stable S2-Delta ou S2-dentelée pour un volume total de 200 microlitres de milieu de Schneider supplémenté.

Placez la plaque sur un agitateur orbital à 150 tr/min. Au bout d’une minute, mélangez le contenu de chaque puits et sortez 20 microlitres pour compter le nombre d’agrégats. Simultanément, prenez une image représentative sous un microscope composé inversé en utilisant un grossissement de 10x.

Pour visualiser les cellules, réglez la caméra sur le microscope et connectez-vous au logiciel pour acquérir l’image. Comptez manuellement les agrégats à l’aide d’un hémacytomètre. Placez l’assiette sur le shaker.

Répétez l’acquisition et le comptage de l’image après cinq minutes et 15 minutes d’agrégation. Effectuez une quantification de transliaison en calculant le nombre d’agrégats par millilitre entre les cellules S2 et les cellules de tomate S2-Delta ou S2-dentelée comme contrôle de fond, et le nombre d’agrégats par millilitre entre les cellules S2-Notch et S2-Delta ou S2-dentelée de tomate. Préparez les cellules réceptrices de signal en plaquant cinq fois 10 à la cinquième cellules S2 dans chaque puits d’une plaque à six puits, dans un millilitre par puits de milieu de Schneider supplémenté.

Ajoutez 7,5 microgrammes d’ARN double brin dans chaque puits et incubez la plaque à 25 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, cotransfectez les cellules traitées à l’ARN double brin pour une concentration totale d’ADN de deux microgrammes par puits à l’aide d’un réactif de transfection commercial. Incuber les cellules S2 transfectées transitoirement à 25 degrés Celsius pendant 24 heures.

Le lendemain, ajoutez 0,7 millimolaire de sulfate de cuivre pour induire l’expression de Notch et des ligands, et incubez à 25 degrés Celsius pendant trois jours. Préparez les cellules émettrices de signaux comme décrit dans la section précédente. Enfin, effectuez l’agrégation entre les cellules d’envoi et de réception de signaux, comme décrit précédemment.

Une forte augmentation a été observée dans le nombre d’agrégats entre une et cinq minutes. Ensuite, le nombre d’agrégats a continué à augmenter jusqu’à 30 minutes, à un rythme plus lent. Des images montrant l’agrégation à trois points temporels montrent que les cellules S2-Notch traitées à l’ARN double brin EGFP ont formé des agrégats avec des cellules S2-Delta, dont le nombre augmente avec le temps.

En revanche, les cellules S2-Notch traitées à l’ARN double brin ont formé des agrégats plus rapidement, et les agrégats étaient plus grands et plus nombreux. Indiquant que la diminution des niveaux de placebo a amélioré la transliaison de Notch avec Delta. La transfection de quantités égales de constructions d’expression Notch et Delta dans les cellules S2 diminue considérablement le nombre d’agrégats formés entre ces cellules et les cellules S2-Delta.

De plus, la diminution de la quantité de cis-Delta entraîne une augmentation du nombre d’agrégats. Ce qui indique que dans la gamme des rapports Notch/cis-Delta utilisés dans ces essais, le cis-Delta peut inhiber la liaison entre Notch et trans-Delta d’une manière dépendante du dosage. La quantification de l’agrégation relative a montré une inhibition comparable de l’agrégation lors du traitement à ARN double brin EGFP et shams.

Une fois tous les réactifs préparés, ce test est simple et peut être exécuté en quelques heures.