Reconstitution des protéines membranaires
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Overview
Reconstitution est le processus du retour une biomolécule isolé à sa forme ou sa fonction originale. Ceci est particulièrement utile pour l’étude des protéines membranaires qui permettent les fonctions cellulaires importantes et influent sur le comportement des lipides à proximité. Pour étudier la fonction des protéines de la membrane purifiée sur place, ils doivent être reconstitués en les intégrant dans une membrane lipidique artificielle.
Cette vidéo présente les concepts de reconstitution de protéines membranaires et les procédures connexes, tels que l’isolement de protéine à l’aide d’un détergent, formation de vésicules artificielles à l’aide de lipides, incorporation de la protéine isolée dans la vésicule artificielle et la séparation du détergent de la solution. Enfin, les deux applications sont couvertes : reconstitution des protéines de transport membranaire et reconstitution des protéines de récolte de la lumière.
Reconstitution est le processus de restauration d’une biomolécule isolé à sa forme originale ou sa fonctionnalité. Cette approche est souvent utilisée lors de l’étude des protéines membranaires qui permettent de nombreux processus cellulaires importants et affectent le comportement des lipides voisines. Cependant, la complexité de l’environnement de la cellule est difficile membrane fonctions protéiques d’étudier in situ. Les protéines peuvent être extraites et purifiées, mais leurs fonctions réelles ne peuvent être évaluées sans une membrane. Les protéines membranaires isolées sont donc reconstitué par l’intégration dans une membrane lipidique artificielle, par exemple un liposome. Cette vidéo va présenter les principes de reconstitution des protéines membranaires, une procédure de reconstitution générale et quelques applications en biochimie.
Membranes cellulaires se composent principalement de phospholipides et de protéines membranaires. Les phospholipides forment une bicouche dont les têtes de phosphate hydrophile interagissent avec l’aqueux intérieur et l’extérieur de la cellule, alors que les queues hydrophobes des acides gras interagissent entre eux dans la bicouche.
Certaines protéines de la membrane n’interagissent avec la membrane par des interactions électrostatiques ou non covalentes. D’autres, appelés « protéines intégrale », sont insérées dans la bicouche lipidique.
Comme la bicouche, protéines de l’integral ont les extrémités hydrophiles et hydrophobe Centre et sont maintenus en place par des interactions hydrophobes. Protéines intégrale qui s’étendent sur l’ensemble membrane sont connus comme « protéines transmembranaires ».
Les interactions entre ces protéines et la membrane sont si fortes que même lyser les cellules ne se séparera pas eux. Un agent tensio-actif spécial appelé un détergent est utilisé pour extraire les protéines. Similaires aux phospholipides, détergents ont la tête hydrophile et lipophile queues et peuvent entrer librement dans la membrane.
À l’intérieur de la membrane, les queues lipophiles du détergent interagissent avec le noyau de protéines hydrophobes. Il entoure la protéine avec une coquille des chefs détergents hydrophiles, qui perturbe les interactions protéines-lipides.
Le complexe protéine-détergent est maintenant facilement séparé de la membrane. Le détergent rend le complexe soluble dans des solutions aqueuses et prêts pour la reconstitution dans une membrane artificielle.
Les protéines sont souvent reconstitués dans les membranes des liposomes, qui sont des vésicules artificielles. Pour préparer les liposomes, lipides séchées sont hydratés et agités pour induire la formation de vésicules. Lorsqu’un détergent est ajouté, il est incorporé dans les membranes de liposome.
Pour reconstituer les protéines, les protéines solubilisées et les liposomes sont combinés, et puis le détergent est supprimé de la solution de dialyse ou adsorption chimique. Les protéines et les liposomes assemblent rapidement dans des protéoliposomes, alors que les groupes hydrophiles sont exposés. Les protéines fonctionnent alors puisqu’ils dans une membrane cellulaire et peuvent être étudiées isolément.
Maintenant que nous avons couvert les rudiments de la reconstitution de la protéine, Let ‘ s go via un protocole pour la reconstitution des protéines de la membrane dans les liposomes.
Pour commencer à isoler les protéines de la membrane, les cellules sont lysées. Ininterrompue de cellules est éliminée par centrifugation.
Le surnageant est centrifugé à une vitesse supérieure pour granuler les membranes. Le culot est remises en suspension et ajouter un détergent pour extraire les protéines.
Les débris restants de la cellule sont enlevée par centrifugation supplémentaire. La protéine est purifiée à partir du surnageant par chromatographie sur colonne et ensuite concentrée ou purifiée davantage selon les besoins.
Pour commencer à préparer les liposomes, une suspension des phospholipides dans un solvant organique est séchée sous azote ou argon.
Les phospholipides sont hydratés avec tampon d’hydratation, et le mélange est sonication pour achever la création les liposomes.
Un détergent est ajouté à solubiliser les liposomes, qui se combine alors avec les protéines.
Le détergent est ensuite retiré par adsorption sur des billes de polystyrène, dialyse ou une colonne de liaison de détergent. Les protéoliposomes qui en résultent sont prêts à être purifié et utilisé dans des expériences ultérieures.
Maintenant que vous êtes familier avec les bases d’une procédure de reconstitution de protéines membranaires, regardons quelques applications de reconstitution de la protéine en biochimie.
Une protéine de membrane-transport a été reconstituée pour acquérir une compréhension plus claire de son mécanisme de transport. Sa reconstitution après fonction a été vérifiée avec un efflux des ions iodure. Ensuite, l’activité de transport a été étudiée en présence de divers inhibiteurs du canal ionique petite molécule et potentialisateurs. De cette façon, les contacts directs de ces petites molécules avec la protéine de transport pourraient être étudiées.
Chlorophylle et protéines membranaires caroténoïde chez les plantes récoltent lumière, promouvoir la séparation des charges et atténuer les dégâts légers. En reconstituant ces protéines de récolte de la lumière, leur dynamique et l’interaction avec pigments pliantes peuvent être étudiés. Les protéines de lumière reconstitués avec cette technique avaient des propriétés optiques très similaires aux protéines natives. Spectroscopie d’émission de fluorescence permet ensuite d’étudier le transfert d’énergie des pigments aux protéines lumière reconstitués.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la reconstitution des protéines membranaires. Reconstitution est un moyen de transférer des protéines importantes à un imitateur de cellule pour complément d’enquête. Cette vidéo a couvert les principes de reconstitution de la protéine, un protocole de reconstitution et quelques applications en biochimie. Merci de regarder !
Procedure
Disclosures
Transcript
Reconstitution is the process of restoring an isolated biomolecule to its original form or functionality. This approach is often used when studying membrane proteins, which enable many important cellular processes and affect the behavior of neighboring lipids. However, the complexity of the cell environment makes membrane protein functions difficult to study in situ. The proteins can be extracted and purified, but their actual functions cannot be evaluated without a membrane. Therefore, isolated membrane proteins are reconstituted by integration into an artificial lipid membrane, such as a liposome. This video will introduce the principles of membrane protein reconstitution, a general reconstitution procedure, and a few applications in biochemistry.
Cell membranes primarily consist of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer in which the hydrophilic phosphate heads interact with the aqueous interior and exterior of the cell, while the hydrophobic fatty acid tails interact with each other in the bilayer.
Some membrane proteins only interact with the membrane by electrostatic or noncovalent interactions. Others, called ‘integral proteins’, are embedded in the lipid bilayer.
Like the bilayer, integral proteins have hydrophilic ends and a hydrophobic center, and are held in place by hydrophobic interactions. Integral proteins that span the entire membrane are known as ‘transmembrane proteins’.
The interactions between these proteins and the membrane are so strong that even lysing the cells will not separate them. A special surfactant called a detergent is used to extract the proteins. Similar to phospholipids, detergents have hydrophilic heads and lipophilic tails, and can enter the membrane freely.
Inside the membrane, the lipophilic tails of the detergent interact with the hydrophobic protein core. This surrounds the protein with a shell of the hydrophilic detergent heads, which disrupts the protein-lipid interactions.
The protein-detergent complex is now easily separated from the membrane. The detergent makes the complex soluble in aqueous solutions, and ready for reconstitution in an artificial membrane.
Proteins are often reconstituted in the membranes of liposomes, which are artificial vesicles. To prepare liposomes, dried lipids are hydrated and agitated to induce vesicle formation. When a detergent is added, it is incorporated into the liposome membranes.
To reconstitute the protein, the solubilized proteins and liposomes are combined, and then the detergent is removed from solution by dialysis or chemical adsorption. The proteins and liposomes rapidly assemble into proteoliposomes, so only the hydrophilic groups are exposed. The proteins then function as they would in a cell membrane, and can be investigated in isolation.
Now that we’ve covered the basics of protein reconstitution, let’s go over a protocol for reconstituting membrane proteins in liposomes.
To begin isolating the membrane proteins, the cells are lysed. Unbroken cells are removed with centrifugation.
The supernatant is centrifuged at a higher speed to pellet the membranes. The pellet is re-suspended and a detergent is added to extract the proteins.
The remaining cell debris is removed by additional centrifugation. The protein is purified from the supernatant with column chromatography and then concentrated or purified further as needed.
To begin preparing the liposomes, a suspension of phospholipids in organic solvent is dried under nitrogen or argon.
The phospholipids are hydrated with hydration buffer, and the mixture is sonicated to finish creating the liposomes.
Detergent is added to solubilize the liposomes, which is then combined with the proteins.
The detergent is then removed by adsorption onto polystyrene beads, dialysis, or a detergent-binding column. The resulting proteoliposomes are ready to be purified and used in subsequent experiments.
Now that you are familiar with the basics of a membrane protein reconstitution procedure, let’s look at a few applications of protein reconstitution in biochemistry.
A membrane-transport protein was reconstituted to gain a clearer understanding of its transport mechanism. Its function post-reconstitution was verified with an efflux of iodide ions. Then, the transport activity was studied in the presence of various small molecule ion channel inhibitors and potentiators. In this way, the direct interactions of these small molecules with the transport protein could be studied.
Chlorophyll and carotenoid-binding membrane proteins in plants harvest light, promote charge separation, and mitigate light damage. By reconstituting these light-harvesting proteins, their folding dynamics and interaction with pigments can be studied. The light-harvesting proteins reconstituted with this technique had very similar optical properties to the native proteins. Fluorescence emission spectroscopy can then be used to study energy transfer from pigments to the reconstituted light-harvesting proteins.
You’ve just watched JoVE’s video on reconstitution of membrane proteins. Reconstitution is a way to transfer important proteins to a cell mimic for further investigation. This video covered the principles of protein reconstitution, a reconstitution protocol, and a few applications in biochemistry. Thanks for watching!
