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La reconstitución es el proceso de restaurar una biomolécula aislada a su forma o funcionalidad original. Este enfoque se utiliza a menudo cuando se estudian las proteínas de membrana, que permiten muchos procesos celulares importantes y afectan el comportamiento de los lípidos vecinos. Sin embargo, la complejidad del entorno celular hace que las funciones de las proteínas de membrana sean difíciles de estudiar in situ. Las proteínas pueden extraerse y purificarse, pero sus funciones reales no pueden evaluarse sin una membrana. Por lo tanto, las proteínas de membrana aisladas se reconstituyen mediante la integración en una membrana lipídica artificial, como un liposoma. Este video presentará los principios de la reconstitución de proteínas de membrana, un procedimiento general de reconstitución y algunas aplicaciones en bioquímica.
Las membranas celulares están formadas principalmente por fosfolípidos y proteínas de membrana. Los fosfolípidos forman una bicapa en la que las cabezas de fosfato hidrofílico interactúan con el interior y el exterior acuosos de la célula, mientras que las colas de ácidos grasos hidrofóbicos interactúan entre sí en la bicapa.
Algunas proteínas de membrana solo interactúan con la membrana mediante interacciones electrostáticas o no covalentes. Otras, llamadas "proteínas integrales", están incrustadas en la bicapa lipídica.
Al igual que la bicapa, las proteínas integrales tienen extremos hidrofílicos y un centro hidrofóbico, y se mantienen en su lugar mediante interacciones hidrofóbicas. Las proteínas integrales que abarcan toda la membrana se conocen como "proteínas transmembrana".
Las interacciones entre estas proteínas y la membrana son tan fuertes que incluso la lisis de las células no las separará. Se utiliza un tensioactivo especial llamado detergente para extraer las proteínas. Al igual que los fosfolípidos, los detergentes tienen cabezas hidrofílicas y colas lipofílicas, y pueden entrar libremente en la membrana.
Dentro de la membrana, las colas lipofílicas del detergente interactúan con el núcleo de la proteína hidrofóbica. Esto rodea la proteína con una capa de cabezas de detergente hidrófilo, lo que interrumpe las interacciones proteína-lípido.
El complejo proteína-detergente ahora se separa fácilmente de la membrana. El detergente hace que el complejo sea soluble en soluciones acuosas y esté listo para su reconstitución en una membrana artificial.
Las proteínas a menudo se reconstituyen en las membranas de los liposomas, que son vesículas artificiales. Para preparar liposomas, los lípidos secos se hidratan y agitan para inducir la formación de vesículas. Cuando se agrega un detergente, se incorpora a las membranas de los liposomas.
Para reconstituir la proteína, se combinan las proteínas solubilizadas y los liposomas, y luego el detergente se elimina de la solución mediante diálisis o adsorción química. Las proteínas y los liposomas se ensamblan rápidamente en proteolisomas, por lo que solo quedan expuestos los grupos hidrofílicos. Las proteínas funcionan como lo harían en una membrana celular y pueden investigarse de forma aislada.
Ahora que hemos cubierto los conceptos básicos de la reconstitución de proteínas, repasemos un protocolo para reconstituir proteínas de membrana en liposomas.
Para comenzar a aislar las proteínas de membrana, se lisan las células. Las células intactas se eliminan con centrifugación.
El sobrenadante se centrifuga a una velocidad más alta para granular las membranas. El pellet se vuelve a suspender y se añade un detergente para extraer las proteínas.
Los restos de celda restantes se eliminan mediante centrifugación adicional. La proteína se purifica a partir del sobrenadante con cromatografía en columna y luego se concentra o purifica aún más según sea necesario.
Para comenzar a preparar los liposomas, se seca una suspensión de fosfolípidos en solvente orgánico bajo nitrógeno o argón.
Los fosfolípidos se hidratan con tampón de hidratación, y la mezcla se sonica para terminar de crear los liposomas.
Se añade detergente para solubilizar los liposomas, que luego se combina con las proteínas.
A continuación, el detergente se elimina por adsorción sobre perlas de poliestireno, diálisis o una columna de unión de detergente. Los proteoliposomas resultantes están listos para ser purificados y utilizados en experimentos posteriores.
Ahora que está familiarizado con los conceptos básicos de un procedimiento de reconstitución de proteínas de membrana, veamos algunas aplicaciones de la reconstitución de proteínas en bioquímica.
Se reconstituyó una proteína transportadora de membrana para obtener una comprensión más clara de su mecanismo de transporte. Su función post-reconstitución se verificó con un eflujo de iones yoduro. A continuación, se estudió la actividad de transporte en presencia de varios inhibidores y potenciadores de canales iónicos de moléculas pequeñas. De esta forma, se podrían estudiar las interacciones directas de estas pequeñas moléculas con la proteína transportadora.
La clorofila y las proteínas de membrana de unión a carotenoides en las plantas recolectan luz, promueven la separación de carga y mitigan el daño de la luz. Al reconstituir estas proteínas recolectoras de luz, se puede estudiar su dinámica de plegamiento e interacción con los pigmentos. Las proteínas recolectoras de luz reconstituidas con esta técnica tenían propiedades ópticas muy similares a las proteínas nativas. La espectroscopia de emisión de fluorescencia se puede utilizar para estudiar la transferencia de energía de los pigmentos a las proteínas reconstituidas que captan la luz.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre la reconstitución de las proteínas de membrana. La reconstitución es una forma de transferir proteínas importantes a una célula para su posterior investigación. Este video cubrió los principios de la reconstitución de proteínas, un protocolo de reconstitución y algunas aplicaciones en bioquímica. ¡Gracias por mirar!