Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

O objetivo geral desta técnica de fotoconversão é distinguir células únicas em um único animal de outras populações de células fluorescentes. Esse método pode ajudar a responder às principais questões de desenvolvimento no campo e nos permitir visualizar a migração de uma única célula ao longo do tempo. A principal vantagem dessa técnica é que ela é minimamente invasiva e pode ser usada para rotular células únicas ou populações maiores.

Além disso, o usuário pode selecionar a região específica de interesse e converter a foto do alvo desejado. Depois de acasalar o peixe-zebra transgênico macho e fêmea expressando uma proteína fotoconversível e coletando os ovos de acordo com o protocolo de texto, use um microscópio de dissecação com uma fonte de luz de 488 nanômetros e conjuntos de filtros GFP para rastrear 24 embriões hpf. Usando uma agulha ou pinça, descorione manualmente os embriões.

Prepare no microondas, cinco mililitros de solução de agarose de baixo ponto de fusão a 0,8%. Uma vez que a agarose é resfriada ao toque, coloque três a quatro peixes transgênicos sox10 eos positivos 48 hpf anestesiados no centro de uma placa de Petri com fundo de lamínula de vidro de dez milímetros. Adicione aproximadamente um milímetro ou agarose suficiente para cobrir a superfície da lamínula.

Em seguida, use uma agulha de sonda para arrumar os peixes de lado, ajustando-os conforme necessário, enquanto a agarose se solidifica, o que levará cerca de dois minutos. Depois que a agarose solidificar por dois minutos, adicione lentamente o meio embrionário contendo 0,02% de ácido aminobenzóico éster tricaína ao prato, até que a superfície inferior do ágar e do prato esteja submersa. Para realizar a microscopia confocal, abra o software confocal e selecione as janelas de captura e foco.

Para realizar a geração de imagens de pré-conversão, na janela de captura e na guia suspensa de configuração de captura, selecione os parâmetros de imagem. Aqui estão as configurações de pilha específicas do laboratório chamadas de imagens de peixes. Coloque a amostra no microscópio confocal e use os botões de ajuste grosso e fino para colocá-la em foco.

Em seguida, abra a janela de foco e localize a região de interesse desejada, como o gânglio da raiz dorsal. No menu do conjunto de filtros, selecione o laser c488, defina a exposição para 300 milissegundos, a potência do laser para cinco e a intensificação para 75. Em seguida, na seção de tipo de captura, marque a caixa 3D.

Na seção Captura 3D, selecione usar posição atual e marque o intervalo em torno da corrente. Na mesma seção, defina o intervalo como 35, o número de planos como 36 e o tamanho do passo como um. Selecione o local atual e clique em iniciar na parte inferior da janela de captura para adquirir uma imagem.

Antes do processo de fotoconversão, certifique-se de verificar duas e três vezes os parâmetros do laser. Às vezes, é necessário reajustar as configurações de conversão, quando a janela de conversão está aberta. Na janela de captura, na guia suspensa de configuração da janela de captura, selecione a configuração de imagem de conversão específica do laboratório.

Aqui, a configuração específica do laboratório é chamada de peixe ablação de chip completo. No menu de filtros, selecione os lasers c488 e c541. Defina as exposições para 300 milissegundos, a potência do laser para cinco e a intensificação para 75, o que produzirá sinal fluorescente suficiente sem causar fotobranqueamento ou toxicidade.

Na janela de foco, clique na guia de fotomanipulação e altere a potência da pilha de laser para dois e clique em ir. Altere o tamanho do bloco raster para um e clique em definir. Em seguida, altere o tamanho do clique duplo para quatro e a linha do laser para v405.

Em seguida, na janela de captura, abra as configurações avançadas de captura. Selecione a guia de fotomanipulação e altere as repetições de clique duplo para duas e clique em OK. Selecione a guia xy na janela de foco.

Na guia de fotomanipulação, verifique novamente os parâmetros do laser. Em seguida, defina as configurações do laser para fotoconverter a célula de interesse, sem fotoconversão das células circundantes. Em Tipo de captura, marque a caixa de lapso de tempo e clique em Iniciar.

Quando a janela de lapso de tempo ao vivo for aberta, selecione a ferramenta de círculo na barra de ferramentas superior. Desenhe um círculo na região mais central da célula, clique com o botão direito do mouse no círculo desenhado, selecione Região FRAP e aguarde três segundos. A área selecionada deve ficar mais escura quando clicar em parar captura.

Se estiver criando mais de um animal, volte para a guia xy no menu de foco e selecione a posição dois. Em seguida, repita a fotoconversão. Para converter uma população de células, siga o protocolo e os perametros a laser abrindo a janela de lapso de tempo.

Agora, em vez de desenhar um círculo para FRAP a região de interesse, use a ferramenta de linha para desenhar uma linha na região de interesse. Em seguida, faça o FRAP da região usando os mesmos parâmetros que acabamos de demonstrar. Depois que todos os pontos forem fotoconvertidos, na guia suspensa de configuração de captura na janela de captura, selecione a configuração de pilha padrão específica do laboratório descrita anteriormente neste vídeo.

Selecione o laser c488 e defina a exposição para 300 milissegundos, a potência do laser para cinco e a intensificação para 75. Selecione o laser c541 e defina a exposição para 500 milissegundos, a potência do laser para dez e a intensificação para 75. Na seção de tipo de captura, marque a caixa 3D.

Na seção Captura 3D, selecione usar posição atual e marque o intervalo em torno da corrente. Na mesma seção, defina o intervalo como 35, o número de planos como 36 e o tamanho da etapa como um. O número do intervalo pode aumentar ou diminuir, para acomodar a profundidade de imagem desejada.

Se houver pontos de multiplicação na guia de foco xy, na janela de captura, selecione a opção de lista de vários pontos. Caso contrário, selecione o local atual. Por fim, na parte inferior da janela de captura, clique em iniciar para adquirir uma imagem.

Esses painéis mostram uma única célula de pré-conversão foto, dentro de um gânglio de um peixe-zebra transgênico, expressando a proteína eos fotoconversível, sob controle da sequência regulatória sox10. Após a fotoconversão, o eos estava distintamente presente na região de interesse, enquanto nenhuma célula vizinha foi marcada. Para demonstrar a utilidade dessa técnica de fotoconversão, uma população de células no lado ventral da medula espinhal foi exposta à luz ultravioleta, usando uma linha.

Em seguida, foram tiradas imagens mostrando a proteína eos fotoconvertida na região da linhagem. A proteína eos não fotoconvertida foi visível em todas as outras áreas. Várias horas após a fotoconversão, foram tiradas imagens idênticas que mostraram células eos positivas fotoconvertidas espalhadas por toda a região da medula espinhal, tanto na região dorsal quanto na ventral.

Esse achado é consistente com a hipótese de que as células espinhais ventrais se mudaram para locais dorsais. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 a 45 minutos, se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de tirar uma imagem pós-conversão, para confirmar se sua região de interesse experimentou a fotoconversão.

Após este procedimento, outros métodos como a imagem em timelapse podem ser realizados para observar a migração e a dinâmica celular ao longo do tempo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como distinguir células individuais dentro de uma população de células fluorescentes. Não se esqueça de que trabalhar com luz ultravioleta pode ser extremamente perigoso e os cuidados necessários devem sempre ser tomados ao realizar este procedimento.

Por exemplo, nunca olhe diretamente para a luz.