Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, den Zell-zu-Zell-Transfer von oszillatorischer Information durch optogenetische Kontrolle und Live-Monitoring der Genexpression zu beobachten. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zu beantworten, wie Zellen über den Notch-Signalweg miteinander kommunizieren, insbesondere wie Zellen die oszillatorischen Informationen untereinander übertragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Dynamik der Genexpression mit sehr hoher Präzision steuern und überwachen können.

Akihiro Isomura, ein Forschungsstipendiat aus meinem Labor, der diese neue Technologie entwickelt hat, wird das Verfahren vorführen. Um Plasmidvektoren von Tol2-basierten optogenetischen Modulen zusammen mit dem Transposase-Expressionsvektor in C2C12-Zellen zu transfizieren, werden zunächst trypsinisierte Zellen mit einem Zellzähler gezählt. Platte 50.000 C2C12-Zellen pro Well in einer 12-Well-Platte einen Tag vor der Transfektion.

Dann co-transfiziert man 0,375 Mikrogramm Tol2-basierter optogenetischer Vektoren, 0,125 Mikrogramm eines Wirkstoffauswahlvektors und 0,5 Mikrogramm des Transposase-Expressionsvektors unter Verwendung des Lipofektionsreagenzes. Trypsinisieren Sie die transfizierten Zellen und plättieren Sie sie einen Tag nach der Transfektion in 100-Millimeter-Kulturschalen. Tauschen Sie das Kulturmedium für die transfizierten Zellen gegen ein Kulturmedium aus, das mit 100 Milligramm pro Milliliter Hygromycin ergänzt ist.

Kultivieren Sie die Zellen drei Tage lang, um nicht transfizierte Zellen zu eliminieren. Beachten Sie, dass ein Wechsel des Mediums nicht erforderlich ist. Als nächstes trypsinisieren Sie die transfizierten Zellen und reinigen eine Population von Zellen, die fluoreszierende Proteine exprimieren, für die Selektion, indem Sie die Empfänger- und lichtempfindlichen Zellen sortieren, wie im Textprotokoll beschrieben.

Richten Sie zwei Arten von Inkubatoren mit oder ohne Lichtquellen für einen lichtinduzierten Zustand oder einen dunklen Zustand ein. Verwenden Sie einen Belichtungsmesser, um die Lichtintensität eines Transilluminators mit blauer LED einzustellen. Messen Sie die Lichtintensität nach dem Schließen der Tür.

Programmieren Sie Timings und Dauer der Lichtbeleuchtung, indem Sie ein Steuerskript auf einen Einplatinen-Mikrocontroller laden, das programmierbare Zeitpläne für die Beleuchtung ermöglicht. Zählen Sie die trypsinisierten Zellen mit einem Zellzähler und plattieren Sie 100.000 lichtempfindliche Senderzellen mit pAI218 und pAI170 auf Kunststoffkulturschalen mit einem Durchmesser von 35 Millimetern. Stellen Sie die Schalen in separate Brutschränke für dunkle und helle Bedingungen.

Halten Sie nach dem Aufstellen der Schalen die Türen der Inkubatoren geschlossen, bis sich die Zelllysate eingesammelt haben. Eineinhalb Tage nach dem Plattieren beginnen Sie mit der Lichtbeleuchtung. Setzen Sie die Zellen keinem unkontrollierten Licht aus, um unerwünschte Photostimulation zu vermeiden.

Führen Sie diesen Schritt also aus, ohne die Tür zu öffnen. Beachten Sie, dass das Öffnen der Tür hier nur zur Demonstration dient. Etwa zwei Tage nach der Beschichtung werden die Probenschalen in 30-Minuten-Intervallen aus den Inkubatoren auf Eis gebracht und mit der Vorbereitung der Zelllysate für die weitere Analyse begonnen.

Um die zellulären Reaktionen auf optische Stimulation durch PMT in Echtzeit zu überwachen, trypsinisieren und zählen Sie zunächst die Anzahl der Sender- und Empfängerzellen mit Standardmethoden. Bereiten Sie eine Suspension mit einem Milliliter Gesamtvolumen von 25.000 Empfänger- und 125.000 Senderzellen vor. Die gemischten Zellen werden in jeder Vertiefung der schwarzen 24-Well-Platten mit Kulturmedium beschichtet, das ein Millimolar Luciferin enthält.

Analysieren Sie die Zellen auf einem Plattenleser für den Luciferase-Assay, um sicherzustellen, dass die Ausgangssignale für das Aufzeichnungssystem nicht zu hoch sind. Setzen Sie anschließend die Platte auf das Aufnahmesystem und starten Sie ein Aufnahmeprogramm. Starten Sie beispielsweise die Lichtbeleuchtung 18 Stunden nach dem Einstellen der Aufnahme.

Für die Echtzeit-Bildgebung von Einzelzellantworten unter Kontrolle optogenetischer Störungen werden zunächst 50.000 Empfänger- und 250.000 Senderzellen auf Schalen mit einem Durchmesser von 27 Millimetern und Glasboden und einem Durchmesser von 35 Millimetern aufgebracht. Stellen Sie sicher, dass die Mischungsverhältnisse und die Gesamtzahl der Zellen korrekt eingestellt sind. Tauschen Sie das Medium einen Tag nach dem Plattieren gegen zwei Milliliter des Aufzeichnungsmediums aus.

Stellen Sie die Glasbodenschale auf ein inverses Mikroskop mit Klimakammer bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Richten Sie eine gekühlte CCD-Kamera ein. Stellen Sie sicher, dass die Temperatur des CCD-Sensors auf den Zielwert abgekühlt ist.

Legen Sie die Parameter für das mehrdimensionale Zeitrafferfenster in der automatischen Erfassungssoftware fest, um Bilder in Fünf-Minuten-Intervallen und mehr als 288 Mal aufzunehmen. Wählen Sie im mehrdimensionalen Zeitrafferfenster einen Lumineszenzkanal aus. Stellen Sie sicher, dass der Auslesemodus auf den langsamen 50-Kilohertz-Auslesemodus eingestellt ist, der für die Reduzierung von Auslesegeräuschen zur Erkennung schwach emittierendes Biolumineszenzlicht entscheidend ist.

Wählen Sie im mehrdimensionalen Zeitrafferfenster Fluoreszenzkanäle aus. Stellen Sie sicher, dass der Auslesemodus auf den schnellen Ein-Megahertz-Modus eingestellt ist, um die für die Fluoreszenzbildgebung erforderliche Zeit zu reduzieren. Stellen Sie schließlich ein Zwei-mal-Zwei-Binning mit einer Belichtungszeit von 400 Millisekunden ein.

Wählen Sie als Nächstes eine Journalregisterkarte aus, um Zeitpläne einzurichten, um die Zellen mit periodischer Blaulichtbeleuchtung zu stimulieren. Klicken Sie auf die Plus-Schaltfläche, um eine neue Journaleinrichtung hinzuzufügen. Wählen Sie eine Journaldatei aus einer Journalbox aus, wählen Sie mehrere Zeitpunkte aus und legen Sie Werte in den Feldern Anfangspunkt und Intervall fest, um die Stimulation zu planen.

Stellen Sie sicher, dass die angegebene Journaldatei sequenzielle Protokolle für die Auswahl der Beleuchtung, des Öffnens des Verschlusses, der Verzögerung, des Schließens des Verschlusses und der Verzögerung enthält. Richten Sie als Nächstes Zeitpläne ein, um die Zellen mit periodischer Blaulichtbeleuchtung zu stimulieren. Starten Sie abschließend die Zeitrafferaufnahme, indem Sie auf die Schaltfläche Acquire klicken.

Extrahieren Sie schließlich einzellige Spuren von Lumineszenzkanälen aus Zeitrafferfilmen, wie im Textprotokoll beschrieben. Repräsentative Ergebnisse optogenetischer Sender-Empfänger-Assays sind hier dargestellt. Die photoinduzierbaren Senderzellen erzeugten erwartungsgemäß oszillatorische Muster der Delta-Ligandenexpression in Gegenwart periodischer Blaulichtbeleuchtung.

Wenn Empfängerzellen mit den lichtempfindlichen Senderzellen co-kultiviert und wiederholter Lichtbeleuchtung ausgesetzt werden, erkennt ein Echtzeit-Biolumineszenz-Aufzeichnungssystem zyklische Reaktionen von Empfängerzellen unter verschiedenen Bedingungen des Mischungsverhältnisses. Darüber hinaus zeigt die Zeitraffermikroskopie mit repetitiver Lichtbeleuchtung auch die synchronisierten Reaktionen der Empfängerzellen auf Einzelzellebene. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Zellbiologie, um zu erforschen, wie dynamische Informationen der Genexpression in Zell-Zell-Interaktionen übertragen werden.