Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Bioengineering

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

תרבית רקמות היסטוטיפית
 
Click here for the English version

תרבית רקמות היסטוטיפית

Summary

למרות שתרבית הרקמות הדו-ממדית נפוצה כבר זמן מה, תאים מתנהגים בצורה מציאותית יותר בתרבית תלת-ממדית, ומחקים באופן הדוק יותר רקמה מקומית. וידאו זה מציג את תרבות הרקמה ההיסטוטיפית, שבה הצמיחה וההתפשטות של קו תא אחד נעשית במטריצה תלת ממדית מהונדסת כדי להגיע לצפיפות תאים גבוהה. כאן, אנו מראים את קצירת התאים מרקמת התורם, ואחריו תרבית תאים על מבנה מהונדס.

Overview

למרות שתרבית הרקמות הדו-ממדית נפוצה כבר זמן מה, תאים מתנהגים בצורה מציאותית יותר בתרבית תלת-ממדית, ומחקים באופן הדוק יותר רקמה מקומית. וידאו זה מציג את תרבות הרקמה ההיסטוטיפית, שבה הצמיחה וההתפשטות של קו תא אחד נעשית במטריצה תלת ממדית מהונדסת כדי להגיע לצפיפות תאים גבוהה. כאן, אנו מראים את קצירת התאים מרקמת התורם, ואחריו תרבית תאים על מבנה מהונדס.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תרבית הרקמה ההיסטוטיפית מאפשרת לגדל תאים בשלושה ממדים, ובכך יוצרת מורפולוגיות של רקמת אין-ויטרו המחקות מקרוב את תפקוד הרקמה הריאליסטי, שיכול לשמש כמבנים בני קיימא לתיקון רקמות. תרבויות אלה הן בדרך כלל מבנים תלת ממדיים המורכבים מסוג תא יחיד הגדל בצפיפות גבוהה. המבנה התלת מימדי, הידוע גם בשם הפיגומים, מחקה את המטריצה החוץ-תאית הטבעית. בהתאם לסוג התא המשמש, פיגומים יכולים להיות מיועדים ליישום מסוים ובדרך כלל לשמש כתבנית לרקמה ביו-מימטית. וידאו זה יציג את היסודות של תרביות רקמות היסטופיות, הליך לבידוד תאים, ואת הייצור והסלולציה של פיגום רקמת משי נקבובי כדי לחקות רקמת לב.

כל הרקמות מורכבות משני מרכיבים בסיסיים, המטריצה החוץ-תאית והתאים הספציפיים לרקמות המאכלסים אותה. המטריצה החוץ-תאית היא רשת של חלבונים מבניים היוצרים סביבה תלת ממדית עבור תאים לכבוש, והתאים שבתוכה נועדו לשחזר את התהליכים הפיזיולוגיים המקוריים של הרקמה. נכון לעכשיו, טכניקה נפוצה המשמשת לדגם רקמה היא תרבית רקמות דו ממדית, שבה תאים מחולקים על מצע שטוח ומותר ליצור סרט דק. באופן כללי, שיטה זו אינה אמינה לשמירה על פנוטיפ in vivo, פונקציות ספציפיות לאיבר, ותא לתא או לתא כדי למצע אינטראקציות הקשריות. תרבית הרקמה היסטוטיפית מקלה על מגבלות אלה על ידי מתן פיגום תלת-ממדי לתאים לגדול עליהם, וכתוצאה מכך רשת צפופה של תאים המחקה מקרוב יותר את מורפוגוגיות התאים המקומיים ומאפשרת פיתוח של רשתות בין-תאיות מציאותיות ומסלולי תקשורת. מגוון רשתות פולימר תלת-ממדיות, כולל הידרוג'לים ומחצלות משי אלקטרו-ספון, מציעות דרכים נוחות לתרבית תאים ספציפיים לרקמות בשלושה ממדים. על מנת לאכלס פיגומים אלה, יש לבודד תאים. תאים ראשוניים המשמשים בסרטון זה נקצרים מרקמה חיה, אשר טחון ולאחר מכן מתעכל בתמיסת אנזים כדי להפריד את תאי היעד מן המטריצה החוץ תאית. ברגע שהתאים מבודדים, ישנן שתי טכניקות המשמשות לזריעת הפיגומים. טכניקת הטיפה כוללת צנרת של תאים על הפיגומים בקצב איטי וקבוע. הטכניקה השנייה, או השעיית התא, שקועה בפיגומים בהשעיית תא. לעתים קרובות, הפיגומים והמתלים מזועזעים כדי לעודד נדידת תאים לתוך המטריצה. שתי הטכניקות גורמות לבנייה ביו-מהונדסת עם צפיפות תאים גבוהה. ההליכים הבאים יהיו כרוכים בבידוד של תאי לב וטכניקת השעיית התא כדי ליצור פיגום ספציפי לתא הלב, כפי שהוא ישמור על המורפולוגיה של רקמת הלב המקומית.

כדי להתחיל בתהליך של בידוד תאים מרקמת התורם, התחל על ידי הבטחת אזור העבודה ומכשירי הניתוח מעוקרים. לאחר מכן, מניחים וילון סטרילי על משטח העבודה בארון הבטיחות הביולוגית. מניחים את המכשירים הכירורגיים הסטריליים על הוילון מבלי לגעת בהם, ולאחר מכן לפתוח להב אזמל מספר 20 סטרילי. לאחר המתת חסד של הדגימה, לעקר את האזור הכירורגי עם כרית גזה ספוג betadine. כאשר מוכן, לאבטח את המדגם ולהתחיל את ההליך הכירורגי כדי לבודד את רקמת העניין. במקרה זה, זה יהיה הלב. לאחר ההפקה, מניחים את הרקמה על קרח בצלחת פטרי המכילה גלוקוז PBS. הסר כל שאריות דם או רקמת חיבור, ולאחר מכן להעביר את הרקמה לצלחת פטרי עם גלוקוז PBS טרי. לאחר מכן, באמצעות מיקרו-מספריים סטריליים ומלקחיים, בזהירות לרכך את דגימות הרקמה לתוך בערך 1 חתיכות מעוקב. באמצעות פיפטה, להעביר את החלקים חוצץ לצינור חרוט. לאחר מכן, להסיר את כל אבל 10 מיליליטר של חוצץ. מוסיפים 7 מיליליטר של תמיסת קולגנאז, ולאחר מכן לנער את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 7 דקות. לאחר מכן, בעדינות pipette 10 פעמים כדי לשבור את חתיכות הרקמה. אפשר לחתיכות להתיישב, ולאחר מכן לשאוף את הנוזל ולהשליך אותו. לאחר מכן, לחזור על העיכול בעדינות pipette את הפתרון כדי לשבור את חתיכות הרקמה. לאחר שהחתיכות התיישבו, משוך את supernatant ולאסוף אותו בצינור חרוט 50 מיליליטר נפרד. לאחר מכן, להוסיף 10 מיליליטר של פתרון STOP לכל צינור חרוט המכיל supernatant כדי לעצור את העיכול.

עכשיו שהתאים הראשיים מבודדים, בואו נמציא פיגום רקמת משי נקבובי. כדי להתחיל, לשפוך 30 מיליליטר של תמיסת משי לתוך עובש. לאחר מכן, לפזר 60 גרם של נתרן מסונה כלוריד באופן שווה על הפתרון. לאחר מכן, אפשר למשי להסתגר ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות. לאחר מכן, מניחים את התבנית בתנור של 60 מעלות למשך שעה אחת כדי לסיים את הקישור הצולב ולאדות כל נוזל שנותר. לאחר פולימר, לטבול את התבנית בכוס של מים מזוקקים במשך 48 שעות כדי עלוקת את המלח. לאחר מכן, להסיר את הפיגומים מן התבנית לחתוך דיסקים קטנים עם אגרוף ביופסיה 5 מ"מ. לקצץ את הדיסקים לגובה של 2 מילימטרים, ולבסוף, להסיר את המרכזים של כל חתיכה עם אגרוף ביופסיה 2 מ"מ כדי ליצור טבעת. לבסוף, autoclave הפיגומים במחזור רטוב במשך 20 דקות.

עם הפיגומים מוכנים, בואו נתחיל את תהליך זריעת התא. ראשית, מניחים פיגום סטרילי אחד לבאר בצלחת 96 באר. לאחר מכן, להוסיף את תרבית התא בינוני כדי לטבול את הפיגומים ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמות כדי לשוות אותם לפחות 30 דקות. לאחר הדגירה, לשאוף את המדיום העודף ולאחר מכן להוסיף את השעיית התא הראשי מבודד לפיגומים. לאחר מכן, להחזיר את הצלחת לאינקובטור ולהשאיר לילה עבור התאים לצרף את הפיגומים. בבוקר שלמחרת, שאפו בקפידה את התאים הלא מחוברים והחליפו ב -200 מיקרוליטרים של מדיום תרבית תאים טריים לכל באר. הפיגומים המתקבלים הם מבנה נקבובי עם צפיפות תאים גבוהה המוכנה לשימוש.

עכשיו שלמדתם איך לבצע תרבית רקמות היסטוטיפית, בואו נסתכל על כמה יישומים מעשיים של חומרים אלה. תרבית רקמות היסטופיפית יכולה ליצור מיקרו-סביבות תאיות המחקות רקמות מקומיות, וכתוצאה מכך הן מסוגלות לספק מודל מתאים לחקר ההתנהגות התאית הנוגעת לסוג תא בודד. לדוגמה, סיבים תלת-ממדיים בפיגומים, המחקים בצורה מדויקת יותר את נישה תאי הגזע שנמצאה ב- vivo, יכולים להיות זרעים עם תאי גזע פלוריפוטנטים כדי לסנן רמזים ביולוגיים ולקבוע את השפעתם על בידול תאי גזע. עבודה זו עשויה בסופו של דבר לספק הבנה גדולה יותר של האופן שבו תאי גזע להבדיל ועשויים להציע תובנות לשיפור בידול התא והתחדשות עבור יישומים הנדסת רקמות. כמו תרביות דינמיות, מיזוג מכני יכול גם לשפר את פיגום הרקמה 3D על ידי חשיפת אותו לעומסים מכניים שונים כי הרקמה הטבעית עלולה לחוות vivo. על ידי החלת דחיסה ועומסים biaxial במהלך צמיחת התא, מורפולוגיה התא מטריצה חוץ תאית משתנה כדי לשקף עומסים מכניים אלה. התוצאה היא פיגום רקמות ביו-מהונדס מותנית מראש עם מבנה תאי הדומה לרקמה מקומית, מה שהופך אותו לאידיאלי להשתלה באזורים שעלולים לחוות כוחות מכניים דומים. לבסוף, מבנים רקמות מהונדס עשוי לשמש גם כדי להחליף או לתקן פגמים ברקמה. על מנת להשיג זאת, פיגום הרקמה חייב להיות כלי דם תחילה, ובכך לאפשר לדם לנוע בחופשיות דרך המבנה. לאחר כלי הדם, הפיגומים יכולים להיות מועברים ומושתלים לתוך פגם הרקמה כדי ליזום תיקון. השתלה מוצלחת יכולה להיות מאושרת מאוחר יותר באמצעות היסתולוגיה, אשר מגלה אם מבנה הרקמה תיקן לחלוטין את האזור הפגוע.

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לתרבות הרקמות ההיסטויפית. כעת עליכם להבין כיצד מוכנים מבנים תלת-ממדיים פשוטים, כיצד תאים ראשוניים מבודדים וזורעים על פיגום, ואת היישומים השונים של תרביות אלה בתחום הביו-הנדסה. תודה שצפיתם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter