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Cultura de tecido histópica

Summary

Embora a cultura tecidual bidimensional tenha sido comum há algum tempo, as células se comportam de forma mais realista em uma cultura tridimensional, e mais intimamente imitam o tecido nativo. Este vídeo introduz a cultura do tecido histotípico, onde o crescimento e a propagação de uma linha celular é feito em uma matriz tridimensional projetada para atingir alta densidade celular. Aqui, mostramos a colheita de células do tecido doador, seguida pela cultura celular em uma construção projetada.

Overview

Embora a cultura tecidual bidimensional tenha sido comum há algum tempo, as células se comportam de forma mais realista em uma cultura tridimensional, e mais intimamente imitam o tecido nativo. Este vídeo introduz a cultura do tecido histotípico, onde o crescimento e a propagação de uma linha celular é feito em uma matriz tridimensional projetada para atingir alta densidade celular. Aqui, mostramos a colheita de células do tecido doador, seguida pela cultura celular em uma construção projetada.

Procedure

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A cultura do tecido histotípico permite que as células sejam cultivadas em três dimensões, criando assim morfologias in vitro de tecido que imitam de perto a função realista do tecido, que pode ser usada como construções viáveis para reparação de tecidos. Essas culturas são tipicamente estruturas tridimensionais que consistem em um único tipo de célula cultivada em alta densidade. A estrutura tridimensional, também conhecida como andaime, imita a matriz extracelular natural. Dependendo do tipo de célula utilizada, os andaimes podem ser projetados para uma aplicação específica e normalmente atuam como um modelo para tecido biomicíetico. Este vídeo introduzirá os fundamentos das culturas de tecido histotípico, um procedimento para o isolamento das células, e a fabricação e celularização de um andaime de tecido de seda poroso para imitar tecido cardíaco.

Todos os tecidos consistem em dois componentes fundamentais, a matriz extracelular e as células específicas do tecido que a habitam. A matriz extracelular é uma rede de proteínas estruturais que criam um ambiente tridimensional para as células ocuparem, e as células dentro dela são destinadas a recapitular os processos fisiológicos nativos do tecido. Atualmente, uma técnica comum utilizada para modelar tecido é a cultura tecidual bidimensional, onde as células são distribuídas em um substrato plano e permitidas a formar um filme fino. Em geral, este método não é confiável para manter um fenótipo in vivo, funções específicas de órgãos e célula a célula ou célula para substrato interações contextuais. A cultura do tecido histotípico alivia essas limitações fornecendo um andaime 3D para que as células cresçam, resultando em uma densa rede de células que imita mais de perto as morfologias celulares nativas e facilita o desenvolvimento de redes intercelulares realistas e vias de comunicação. Uma variedade de redes de polímeros 3D, incluindo hidrogéis e tapetes de seda eletrospun, oferecem maneiras convenientes de cultivar células específicas do tecido em três dimensões. Para povoar esses andaimes, as células devem ser isoladas. As células primárias utilizadas neste vídeo são colhidas a partir do tecido vivo, que é picado e depois digerido em uma solução enzimática para separar as células-alvo da matriz extracelular. Uma vez que as células são isoladas, existem duas técnicas usadas para semear os andaimes. A técnica de gotícula envolve a pipetação de uma solução de células no andaime a uma velocidade lenta e constante. A segunda, ou técnica de suspensão celular, submerge o andaime em uma suspensão celular. Muitas vezes, o andaime e a suspensão são abalados para incentivar a migração celular para a matriz. Ambas as técnicas resultam em construções bio-projetadas com altas densidades celulares. Os seguintes procedimentos envolverão o isolamento das células cardíacas e a técnica de suspensão celular para criar um andaime específico para células cardíacas, pois reterá a morfologia do tecido cardíaco nativo.

Para iniciar o processo de isolação de células a partir do tecido doador, comece garantindo que a área de trabalho e os instrumentos de dissecção sejam esterilizados. Em seguida, coloque uma cortina estéril na superfície de trabalho no armário de biosegurança. Coloque os instrumentos cirúrgicos estéreis sobre a cortina sem tocá-los e, em seguida, abra uma lâmina de bisturi estéril de número 20. Após eutanásia da amostra, esterilize a área cirúrgica com uma gaze encharcada de betadina. Quando estiver pronto, proteja a amostra e inicie o procedimento cirúrgico para isolar o tecido de interesse. Neste caso, será o coração. Uma vez excisado, coloque o tecido no gelo na placa de Petri contendo glicose PBS. Remova qualquer sangue residual ou tecido conjuntivo, e depois transfira o tecido para uma placa de Petri com glicose PBS fresca. Em seguida, usando micro-tesouras estéreis e fórceps, pique cuidadosamente as amostras de tecido em cerca de 1 milímetro cúbico. Usando uma pipeta, transfira as peças e tampão para um tubo cônico. Em seguida, remova todos, menos 10 mililitros de tampão. Adicione 7 mililitros de solução de colagenase e, em seguida, agite a mistura a 37 graus Celsius por 7 minutos. Em seguida, gentilmente pipeta 10 vezes para quebrar os pedaços de tecido. Deixe as peças se instalarem e, em seguida, aspire o líquido e descarte-o. Em seguida, repita a digestão e pipeta suavemente a solução para quebrar os pedaços de tecido. Depois que as peças se instalarem, desenhe o supernante e colete-o em um tubo cônico separado de 50 mililitros. Em seguida, adicione 10 mililitros de solução STOP a cada tubo cônico contendo supernanato para parar a digestão.

Agora que as células primárias foram isoladas, vamos fabricar um andaime de tecido de seda poroso. Para começar, despeje 30 mililitros da solução de seda em um molde. Em seguida, espalhe 60 gramas de cloreto de sódio peneirado uniformemente sobre a solução. Em seguida, deixe a seda polimerizar imperturbável à temperatura ambiente por 48 horas. Em seguida, coloque o molde em um forno de 60 graus por 1 hora para finalizar a ligação cruzada e evaporar qualquer líquido restante. Uma vez polimerizado, mergulhe o molde em um béquer de água destilada por 48 horas para tirar o sal. Em seguida, remova o andaime do molde e corte pequenos discos com um soco de biópsia de 5 milímetros. Corte os discos a uma altura de 2 milímetros e, finalmente, remova os centros de cada peça com um soco de biópsia de 2 milímetros para criar um anel. Por fim, autoclave os andaimes em um ciclo úmido por 20 minutos.

Com o andaime preparado, vamos começar o processo de semeadura celular. Primeiro, coloque um andaime estéril por poço em uma placa de 96 poços. Em seguida, adicione meio de cultura celular para imergir os andaimes e incubar a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura tecidual para equilibrá-los por pelo menos 30 minutos. Após a incubação, aspire o meio de excesso e, em seguida, adicione a suspensão celular primária isolada aos andaimes. Em seguida, devolva a placa à incubadora e deixe durante a noite para as células se prenderem aos andaimes. Na manhã seguinte, aspire cuidadosamente as células não anexadas e substitua por 200 microliters de meio de cultura celular fresca por poço. O andaime resultante é uma construção porosa com uma alta densidade celular pronta para ser usada.

Agora que você aprendeu a realizar a cultura do tecido histotípico, vamos olhar para algumas aplicações práticas desses materiais. A cultura do tecido histotípico pode criar microambientais celulares que imitam tecidos nativos e, como resultado, são capazes de fornecer um modelo adequado para o estudo do comportamento celular em relação a um único tipo de célula. Por exemplo, a fibra 3D em andaimes, que imitam com mais precisão o nicho de células-tronco encontrada in vivo, pode ser semeada com células-tronco pluripotentes para rastrear pistas biológicas e determinar seus efeitos sobre a diferenciação de células-tronco. Este trabalho pode, em última análise, fornecer uma maior compreensão de como as células-tronco se diferenciam e podem oferecer insights sobre o aprimoramento da diferenciação celular e da regeneração para aplicações de engenharia de tecidos. Como culturas dinâmicas, o condicionamento mecânico também pode melhorar o andaime de tecido 3D, submetendo-o a várias cargas mecânicas que o tecido natural pode experimentar in vivo. Aplicando a compressão e as cargas biaxiais durante o crescimento celular, a morfologia celular e a matriz extracelular são alteradas para refletir essas cargas mecânicas. Isso resulta em um andaime de tecido bio-projetado pré-condicionado com uma estrutura celular semelhante ao tecido nativo, tornando-o ideal para implantação em áreas que podem experimentar forças mecânicas semelhantes. Finalmente, construções de tecidos projetadas também podem ser usadas para substituir ou reparar defeitos teciduais. Para isso, o andaime tecidual deve ser primeiro vascularizado, permitindo assim que o sangue se mova livremente através da construção. Uma vez vascularizado, o andaime pode ser transferido e implantado no defeito tecidual para iniciar a reparação. Enxerto bem sucedido pode ser confirmado posteriormente através da histologia, que revela se a construção do tecido reparou completamente a área danificada.

Você acabou de assistir a introdução de Jove à cultura de tecido histópico. Agora você deve entender como estruturas 3D simples são preparadas, como as células primárias são isoladas e semeadas em um andaime, e as várias aplicações dessas culturas no campo da bioengenharia. Obrigado por assistir.

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Disclosures

Nenhum conflito de interesses declarado.

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