Bioengineering
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Summary November 16th, 2018
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为修复大型骨病变而设计的新型生物材料的数量不断增加, 目的是加强骨愈合和克服与骨移植相关的并发症。在这里, 我们提出了一个多学科战略的临床前生物相容性测试的生物材料骨修复。
Transcript
这些方法有助于回答生物材料领域的关键问题。特别是骨骼再生。它们用于评估生物材料的有效性和潜在的免疫反应。
这个多学科平台的主要优点是，它为预测用于骨质修复的生物材料的生物相容性提供了一系列参数。这些体外和体内骨技术的影响延伸到其他骨骼疾病。由于需要临床前筛选新的骨科生物材料。
皮肤学方法可以提供骨愈合的生物材料见解，它也可以应用于生物材料评估任何其他临床指示。在增加成骨矿化培养本14天后，从原发性成骨细胞中吸气培养。用 0.5 毫升 1X PBS 冲洗两次。
然后通过加入0.5毫升10%缓冲的甲醛溶液并在室温下孵育10分钟来修复细胞。10分钟后，用一次使用移液器吸出10%缓冲的甲醛，用0.5毫升超纯水洗涤两次。然后添加250微升40毫摩尔阿里扎林红S染色溶液到固定的成骨细胞。
在室温下将板孵育10分钟，以每分钟100次的震动。使用染色溶液孵育后，用一次使用移液器吸吸染色溶液，然后用一毫升超纯水冲洗。重复此步骤 5 到 10 次，直到冲洗溶液清除清楚，以去除非特异性染色。
吸气后的最后洗涤，加入一毫升的冷PBS。和以前一样，在室温下在摇床上孵育盘子10分钟。接下来，将染色的磷酸三钙电池盘转移到新井中，然后用平板扫描仪扫描板材以记录矿化。
图像捕获后，加入250微升10%的氯化物溶液，摇动15分钟，提取阿里扎林红S染料。接下来，将溶液从油井转移到单独的1.5毫升管和离心机在17，000 x g室温下5分钟。在1.5毫升管中，以1：10至1：20的稀释配给用10%的氯化物溶液稀释提取物。
然后将每个稀释样品的300微升转移到96孔板的孔中。包括两口只含有10%氯乙烯的空白井。接下来，通过稀释40毫摩尔阿里扎林红S染色溶液和10%的氯酸乙基溶液，准备7个Alizarin Red S参考标准，从4400微摩尔开始，生成标准曲线。
将每个标准 300 微升加载到板中。最后，阅读样品、空白和参考标准在520纳米的吸收剂。使用无菌剪刀将骨髓骨质原体前体从安乐死小鼠的股骨和头骨中分离，将腿部从臀部关节的体内取出。
切开膝盖和脚踝关节的四肢，用无菌的手术刀和钳子切除软组织。切断表皮。将一个27表针插入注射器上，注射器中装满了一毫升的骨生长介质，然后将骨髓冲洗成6厘米的无菌培养皿中。
对所有股骨和头骨重复此值后，将细胞悬浮液转移到 50 毫升锥形管中。用五毫升骨生长介质清洗六厘米培养皿，并转移到相同的 50 毫升锥形管中。在4摄氏度下以350xg离心5分钟。
离心后，每井骨细胞分化介质将细胞重新悬浮在一毫升内。一只BALB/c小鼠为一个24井培养板提供了足够数量的骨质前体。将悬浮在骨生长介质中的原发性成骨细胞添加到生物材料上，并在每平方厘米8.8*10~4细胞下对控制。
这里使用β三钙磷酸盐盘、受控牛骨和组织培养塑料。在37摄氏度的二氧化碳中孵育24小时。24小时后，在培养的原发性骨细胞中加入新鲜分离的骨髓骨细胞前体和骨细胞分化介质，在37摄氏度的二氧化碳下返回孵化器，进行5天的培养。
每隔一天用新鲜准备好的骨质分化介质代替该介质。然后染色骨质，用于耐酸磷酸酶，以评估分化。剃掉麻醉的八周大BALB/c小鼠的头皮，用7.5%的波维酮碘溶液和70%乙醇清洁表面。
用眼科软膏盖住眼睛，防止手术过程中干燥。由于缺乏对头趾和尾部捏紧的反应，确保适当的麻醉水平。然后，在做中线下垂切口后，用手术刀刮除右胆骨上方的副结缔组织。
然后使用直径为四毫米的无菌牙骨，每分钟旋转 2000 次，在右骨骨中产生严重大小的缺陷。不断用无菌盐水溶液灌溉该区域，同时切入正确的骨质，切入内皮质和一些内皮质。为防止对 Dera Mater 造成损坏，请使用小型周密电梯突破剩余的内皮质。
然后使用钳子小心地抬起钙质骨骼并将其取出。由此产生的缺陷应该是圆形的，直径约为3.5毫米。接下来，用无菌PBS预贴的磷酸磷酸胶原蛋白泡沫填充钙质缺陷。
为了保持生物材料就位，在缺陷的末尾在两个相反点涂抹0.5微升组织粘合剂。然后用不可吸收的缝合线关闭皮肤。将麻醉小鼠放在其背部，剃掉腹部毛皮，用7.5%的波维酮碘溶液和70%乙醇清洁剃光的表面。
沿着腹部的线状皮肤进行八毫米长的中线切口后，将PBS浸泡在皮肤下。然后用不可吸收的缝合缝合皮肤。植入后八周，用安乐死小鼠的周围组织切除植入位点。
此图像表明，与培养7天和14天组织培养塑料的生长相比，在开放式棒中显示的β三钙磷酸盐盘的生长不会影响成骨细胞的生存能力。14天后，养殖的成骨细胞被染上了阿里扎林红S。与仅培养的成骨细胞相比，矿化介质控制中的矿化程度更高。
并在悬浮培养井中的β三钙磷酸盐盘上。当手术诱发的关键大小钙质缺陷留空时，观察到覆盖整个缺陷的薄层，但在手术后12周没有明显骨骼形成。相比之下，当缺陷中含有磷酸原原蛋白泡沫的β三钙时，泡沫残留物被密集的纤维组织包围，包括一些血管和炎症细胞，在没有骨形成证据的情况下，将缺陷区域桥接。
在皮下β三钙磷酸胶原蛋白泡沫植入后，在血氧林和Eosin染色部分观察到异体巨型细胞的炎症反应，在8周内在马森的三色染色部分发现纤维化的证据。相比之下，假对症的植入位点具有最小的炎症和没有纤维化。在尝试此过程时，在不伤害动物的情况下精确且可重复地对钙分进行分切非常重要。
按照这个程序的其他方法，如骨细胞分化测定和高通量到近位免疫模型可以预制，以回答其他问题，如骨细胞对生物材料的反应和免疫反应的类型。
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