Biochemistry
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सेल-प्रकोष्ठ के Microemulsions में चक्र दोलनों का पुनर्गठन-मुक्त Xenopus Egg अर्क
Summary September 27th, 2018
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हम इन विट्रो में स्व-निरंतर mitotic दोलनों की पीढ़ी के लिए एक विधि वर्तमान में Xenopus laevis के अंडे के अर्क encapsulating द्वारा पानी में तेल microemulsions ।
Transcript
यह विधि सिस्टम जीव विज्ञान क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है, जैसे मिटोटिक नेटवर्क के पीछे विनियमन तंत्र और कोशिका चक्र घड़ी के गतिशील गुण और कार्य। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह प्रत्येक में कई सेल चक्रों के साथ बड़ी मात्रा में बूंदों को उत्पन्न करेगा, जो हमें मात्रात्मक हेरफेर और विश्लेषण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट फ्रेमवर्क प्रदान करेगा। शुरू करने के लिए, अंडे के बैचों को त्यागें जिनमें पशु और वनस्पति ध्रुवों या पशु ध्रुवों के शीर्ष पर अनियमित सफेद धब्बे के बीच अस्पष्ट सीमाएं हैं।
इसके बाद, एक मादा मेंढक से अंडे के एक उपयुक्त बैच का चयन करें, और अंडे को 600-मिलीलीटर बीकर में स्थानांतरित करें। 0.2x एमएमआर बफर की अधिकता डालें, और धीरे-धीरे अंडे में 1x निकालने बफर में सिस्टीन जोड़ें। इसके बाद अंडे के जेली कोट को हटाने के लिए बीकर को हाथ से जोर से हिलाएं।
इस धोने को तीन बार सिस्टीन बफर के कुल 800 मिलीलीटर के साथ दोहराएं या अंडे कुल होने तक और बीकर के तल पर व्यवस्थित न करें। जेली कोट निकालने के बाद, अंडे को 0.2x एमएमआर समाधान के एक लीटर में चार बार धोएं। सफेद बारी है कि अंडे लेने और त्यागने के लिए एक गिलास पिपेट का प्रयोग करें।
बीकर से एमएमआर बफर डालो, और अंडे में कैल्शियम आयनोफोर समाधान के 200 मिलीलीटर जोड़ें। अंडे को धीरे-धीरे हिलाने के लिए ग्लास पिपेट का उपयोग करें जब तक कि वे सक्रिय न हो जाएं, और कैल्शियम आयनोफोर समाधान को हटा दें। अंडे को कैल्शियम आयनोफोर समाधान में बहुत लंबे समय तक छोड़ने से एपोप्टोसिस शुरू हो जाएगा।
हम अंडे को 1.5 मिनट तक हिलाते हैं और सक्रियण दक्षता की जांच करते हैं। यदि वे सक्रिय नहीं हैं, तो सरगर्मी फिर से शुरू करें, और 90% सक्रियण प्राप्त होने तक अधिक बार जांच करें। अंडे बीकर के तल पर बसने के बाद, सक्रियण दक्षता की जांच करें।
अच्छी तरह से सक्रिय अंडे में लगभग 25% पशु ध्रुव और वनस्पति ध्रुव का 75% होता है। इसके बाद, अंडे को दो बार एक्सटीज़ अवरोधकों के साथ पूरक एक्सट्रैक्ट बफर के 50 मिलीलीटर की कुल मात्रा के साथ धोएं। फिर, ध्यान से अंडे को 0.4-मिलीलीटर स्नैप-कैप माइक्रोट्यूब में स्थानांतरित करें।
200 ग्राम पर 60 सेकंड के लिए माइक्रोट्यूब को सेंट्रलाइज करें और फिर अंडे पैक करने के लिए 30 सेकंड के लिए 600 ग्राम पर। फिर, प्रत्येक चरण के बाद अंडे के शीर्ष पर अतिरिक्त बफर को हटाने के लिए एक ग्लास पाश्चर पिपेट का उपयोग करें। इसके बाद अंडे को 15, 000 ग्राम पर 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर क्रश करें।
कुचल अंडे की तीन परतों को अलग करने और कच्चे साइटोप्लाज्म को बीच की परत में रखने के लिए ट्यूबों को काटने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें। फिर, अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों को साफ करने के लिए क्रूड साइटोप्लाज्म को स्थानांतरित करें। साइटोप्लाज्म को प्रोटीज अवरोधकों और साइटोचलासिन बी के साथ 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर प्रत्येक में पूरक करें।
पांच मिनट के लिए 15, 000 ग्राम और चार डिग्री सेल्सियस पर क्रूड साइटोप्लाज्म को सेंट्रलाइज करें। फिर, ट्यूब को काटने और साइटोप्लाज्म को बीच की परत में रखने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें। ताजा तैयार अर्क को बर्फ पर रखें।
सबसे पहले, तैयार अर्क में सिक्योरिन-म्हेरी एमआरएनए जोड़ें। इसके बाद, निकालने एमआरएनए मिश्रण में 2% पीएफपीई-खूंटी फ्लोरोसर्जार्थंट के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। बूंदों को उत्पन्न करने के लिए भंवर मिक्सर का उपयोग करें, भंवर की गति और आवश्यकतानुसार अवधि को समायोजित करें।
फिर, नेत्रहीन बूंदों का निरीक्षण करने के लिए सुनिश्चित करें कि वे आकार में एक समान हैं । 200-माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके, शीर्ष पर तैरती बूंदों को स्थानांतरित करें और एक पीसीआर ट्यूब में सर्फेक्टेंट की बराबर मात्रा। बूंद परत में एक गिलास ट्यूब डुबकी, और बूंदों ट्यूब के लगभग ७५% भरने तक इंतजार ।
फिर, ट्यूब को सर्फेक्टेंट परत में धकेलें, और ट्यूब को पूरी तरह से भर दें। इसके बाद, खनिज तेल के साथ एक गिलास तली हुई डिश भरें। फिर, तेल में बूंद से भरी ट्यूब विसर्जित करने के लिए ठीक चिमटी का उपयोग करें।
किसी भी दिखाई मलबे या लीक बूंदों को हटाने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें। बूंदों के मूवमेंट और रिसाव से बचने के लिए बूंदों से भरी कांच की नली को मिनरल ऑयल के नीचे सावधानी से डुबो देना चाहिए। हम या तो संतुलन के साथ दोनों सिरों पर ट्यूब धक्का या ट्यूब के सिरों पर खनिज तेल की कुछ बूंदें एक साथ पहले जोड़ सकते हैं ।
इसके बाद, बूंदों को छवि देने के लिए मोटराइज्ड जाइल चरण से लैस एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। उज्ज्वल क्षेत्र और कई फ्लोरेसेंस चैनलों में रिकॉर्ड समय-चूक वीडियो हर छह से नौ मिनट में जब तक बूंदों अपनी गतिविधि खो देते हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, नाभिक के साथ सरल, परमाणु मुक्त कोशिकाओं और जटिल कोशिकाओं दोनों में माइटोटिक दोलन का उत्पादन किया गया था।
नाभिक मुक्त बूंदों ने 92 घंटे से अधिक 30 अण्डाकारित चक्रों तक मिटोटिक दोलन उत्पन्न किया। डाउनस्ट्रीम माइटोटिक घटनाओं को चलाने के लिए माइटोटिक ऑसिलेटर की क्षमता की भी जांच की गई। स्व-निरंतर माइटोटिक ऑसिलेटर ने अलग-अलग सेल-चक्र चरणों के स्वायत्त परिवर्तन के माध्यम से मनाए गए परमाणु आकृति विज्ञान के परिवर्तनों को खदेड़ दिया।
इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, निकालने के समय को ध्यान में रखना याद रखना महत्वपूर्ण है, क्योंकि यह समय के प्रति संवेदनशील है, और हमेशा अंडे और बर्फ पर निकालने के लिए रखते हैं। इसके विकास के बाद, इस तकनीक ने सिस्टम जीव विज्ञान के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए जटिल घड़ी गुणों के मौलिक सिद्धांतों का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया, जैसे ज़ेनोपस लेविस में ट्यूनेबिलिटी और स्टोचस्टिकिटी।
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