Isolasjonen av Glomeruli og i Vivo merking av Glomerular celle overflaten proteiner

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i nefrologifeltet om rollen som celleoverflateproteinhandel i proteinurisk og ikke proteinnyresykdom. De viktigste fordelene med denne teknikken er at det letter studiet av celleoverflateproteinhandel in-vivo, og at mer enn ett protein kan analyseres per eksperiment. Selv om denne metoden kan gi innsikt i glomerulær celleoverflatehandel, kan også brukes på andre organsystemer som er perfundert og er tilgjengelige ved isolasjonsteknikker.

Begynn med å bekrefte mangel på respons på tåklemme og desinfisere ventral side av den bedøvede musen med 70% isopropyl. Lag en median skjære gjennom huden fra bekkenet til brystbenet og bruk pinsett for å fjerne huden fra magefascia. Skjær huden på begge sider av abdominal midtlinjen og lag et medium gjennom bukmuskellaget fra blæren til xiphoid.

Bruk saks og tang til å dele musklene i fire kvadranter Og bruk to kirurgiske klemmer for å sikre de to øverste kvadrantene mot dyrenes hals. Plasser dyret under et dissekerende mikroskop og bruk et sterilt bytte for å flytte til side de viscerale organene. Bruk fin saks, kutt det leverphreniske ligamentet.

Bruk fine kirurgiske pinsett, plasser en sutur rundt leveren mesenterisk arterie branial av nyrearteriene. Og rundt aorta, proksimal til nyrearteriene, ved binyrene. Frigjør distal aorta fra fascia, fett og annet vev.

Deretter klemmer vena cava og aorta på høyden av bifurcation og legger en annen sutur rundt aorta distal av nyrearteriene. Bruk pinsett for å stramme den proksimale aortasuturen, dempe blodstrømmen og kutte et lite hull halvparten av diameteren på aorta i aorta, distal til nyrearteriene. Sett inn et 10 centimeter kateter festet til en 10 milliliter sprøyte som inneholder fem milliliter iskald PBS pluss kalsium og magnesium i aorta.

Og fest kateteret med de forberedte ligaturene. Deretter begynner du å perfusere nyrene med en to milliliter per minutt strømningshastighet. Bruk fin saks til å kutte et hull i nyrevenen ved nyrearteriene og stramme suturen rundt lever- og mesenteriske arterier.

Etter at hele volumet av PBS er levert erstatte perfusat med fem milliliter iskald PBS pluss kalsium og magnesium supplert med 0,5 milligram per milliliter biotin for overflatemerking. Fortsett å perfuse nyrene med en to milliliter per minutt strømningshastighet. Når hele volumet er levert, fest en sprøyte som inneholder fem milliliter iskald PBS pluss kalsium og magnesium supplert med 100 millimolarglysin til kateteret.

Slukke glomeruli med alle fem milliliter av glysinløsningen med en to milliliter per minutt strømningshastighet. Deretter perfuse nyrene med fem milliliter iskald PBS pluss kalsium og magnesium supplert med 200 mikroliter magnetiske perler per milliliter ved en to milliliter per minutt strømningshastighet. Emboliseringen av glomeruli med de brune magnetiske perlene vil være synlig på nyreoverflaten.

Når alle perlene er levert, fjern nyrekapselen og høst nyrene på hilum. Legg nyrene i en 10 centimeter cellekulturrett som inneholder 15 milliliter PBS pluss kalsium og magnesium. Bruk et nytt dobbeltkantet blad for å kutte nyrene i de minste delene som er mulig.

Overfør vevet til et to milliliter rør som inneholder en milliliter kollagenase A i 30 minutter ved 37 grader Celsius, bland vevsløsningen forsiktig før og etter fordøyelsen med en modifisert 1000 mikroliter pipettespiss. På slutten av inkubasjonen filtrerer du det fordøyde vevet gjennom en 100 mikron cellesil. Bruk en celleskraper og iskald PBS pluss kalsium og magnesium for å mose det gjenværende vevet gjennom cellesilen.

Ta det endelige volumet av nyrene enkeltcelle suspensjon opp til 50 milliliter med frisk iskald PBS pluss kalsium og magnesium og samle nyrecellene ved sentrifugering. Fjern supernatanten og suspender pelleten igjen med litt mindre enn 1,5 milliliter iskald PBS pluss kalsium og magnesium mens du virvler og overfører den glomerulære suspensjonen til et nytt to milliliterrør. For å vaske glomeruli, legg røret i en magnet for å aggregere glomeruli.

Etter ett minutt bruker du en 1000 mikroliter pipette for å fjerne supernatanten. Og fjern røret fra magneten. Tilsett en milliliter PBS pluss kalsium og magnesium til vevet.

Pipette glomeruli opp og ned en gang og vortex cellene. Returner røret til magneten og vask glomeruli igjen som nettopp demonstrert. Inntil en prøve renhet har nådd minst 90%av lys mikroskop analyse på en 40 til 100 X forstørrelse.

Deretter samler den magnetiske perlen renset glomeruli ved sentrifugering. For å oppnå en større enn 95% renhet, måtte glomeruli vaskes grundig som demonstrert. Biotinperfusjon forenkler merking av kapillære løkker i biotin, men ikke kontrollertperfused mus nyrer.

Immunnedbør av biotinfraksjonen av glomerulære ekstrakter avslører at de glomerulære transmembraneproteinene nephrin og podokalyxin er immunforefall med biotin, men ikke med kontrollfraksjonen. Farging av immunforebukk fraksjon med streptavidin bekrefter videre tilstedeværelsen av biotin laded nephrin i biotinperfused, men ikke kontrollere perfused dyr. Endotelprotein vaskulær endotelkaderin og intracellulært vedheftmolekyl to er også immunoprecipitated innenfor biotinfraksjonen.

I den tidlige fasen av nefrotoksisk nefritt observeres et redusert uttrykk for celleoverflate nephrin hos nefrotoksiske nefritt dyr sammenlignet med kontroller. Faktisk viser densitometisk analyse en betydelig reduksjon av biotin laded nephrin hos nefrotoksiske nefritt dyr sammenlignet med kontrollere. Kvantitativ analyse av det totale nephrin-forholdet viser ingen signifikante forskjeller mellom kontroll og nefrotoksisk nefritt mus.

I tillegg observeres like mengder podocytter i nefrotoksisk nefritt og kontrollerer dyr. I sen nefrotoksisk nefritt viser nefrotoksiske nefrotiske dyr en gjenoppretting av nephrinuttrykk uten signifikante forskjeller i celleoverflaten nephrin målt mellom kontroll og nefrotoksiske nefrotiske mus og en total total nephrinreduksjon i nefrotoksiske nefrotiske dyr. Videre reduseres podocytetallene sammenlignet med kontrolldyr.

Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å holde sprøytene boblefri under deres forbindelse for å unngå luftemboli av glomeruli og å jobbe under iskalde forhold når nyreperfusjonen har startet. Etter denne prosedyren kan andre metoder som isolering av glomeruli RNA og protein utføres for å svare på flere spørsmål om proteinuttrykk eller interaksjoner i sunne og syke nyrer.