Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
4D-mikroskopi af gær
Chapters
Summary April 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol beskriver analysen af fluorescently mærkede intracellulære rum i spirende gær ved hjælp af multi-Color 4D (time-lapse 3D) confokal mikroskopi. Billedbehandlings parametrene vælges til at opfange passende signaler, samtidig med at foto skader begrænses. Brugerdefinerede ImageJ plugins tillader, at mærkede strukturer spores og analyseres kvantitativt.
Transcript
Denne metode sporer strukturer i gærceller i tre dimensioner over mange minutter, hvilket giver os mulighed for at studere dynamikken i intracellulære organeller og rum. 4D-billeddannelse sikrer, at vi kan drage pålidelige konklusioner om intracellulær dynamik, især for strukturer eller markører, der kan være forbigående. Demonstration af proceduren vil være Natalie Johnson, en postdoc fra mit laboratorium.
Begynd med at dyrke en overnight kultur af gær stamme af interesse i fem milliliter af ikke-fluorescerende syntetisk defineret, eller NSD, medium, i en 15 milliliter forvirret kolbe med god befrugtning, ved 23 grader Celsius. Tre til fire timer før analysen fortyndes den logaritmiske fase gærkultur i frisk NSD-medium, således at den endelige optiske tæthed ved 600 nanometer eller OD600 vil være 0,5 til 0,8 på billeddannelsestidstid. Mindst en time før kulturen er klar, centrifuge en aliquot af en to milligram per milliliter Concanavalin En løsning i fem minutter ved fuld hastighed, at pellet eventuelle partikler, og tilsæt 250 mikroliter af supernatant i en ren 35 millimeter glas bund mikroskopi fad.
Efter 15 minutter vaskes skålen to til tre gange med to milliliter destilleret vand pr. vask, og der tilsættes 250 mikroliter af gærkulturen til Concanavalin A-belagt skål, efter at den er tørret. Vent 10 minutter på at lade cellerne klæbe, før skålen vaskes to til tre gange mere med to milliliter frisk NSD-medium. Derefter dække cellerne med to milliliter frisk NSD.
Hvis du vil afbilde gærcellerne, skal du vælge et 63X olienedbætningsobjektiv med en numerisk blændeåbning på mindst 1,4 på et konfokalt lysmikroskop. Her kan en 100X objektiv også bruges i stedet for en 63X objektiv. Derefter placere parabol på objektivet linse, plettet med nedsænkning olie.
Vælg xyzt i rullemenuen under fanen Anskaffelsestilstand. Under fanen XY skal du formatere rammestørrelsen til 256 bredde med 128 højde. Brug den maksimale scanningshastighed, som typisk er i rækkefølge efter otte kilohertz.
Slå tovejs X-scanning til, hvis den er tilgængelig, og juster zoomfaktoren til ni, hvilket vil resultere i en pixelstørrelse på ca. 80 nanometer. Hvis der bruges en 100X-målsætning, skal du justere zoomfaktoren i overensstemmelse hermed for at opretholde en pixelstørrelse på ca. 80 nanometer. Sæt derefter linjeakkumulering til fire eller seks.
Indstil pinhole til 1,2 Luftige enheder, og tænd for den hvide lys laser, hvis det er tilgængeligt. Derefter indstille excitation bølgelængde og procent laser magt for hver fluorescens kanal. Hvis det er tilgængeligt, skal du aktivere brugen af fotonoptællingstilstand under fanen Konfiguration ved at fravælge maksimal integrationstid.
For hver fluorescenskanal skal du tildele en højfølsom detektor, indstille bølgelængdeområdet for emissionen og aktivere fotontællingstilstand, hvis den er tilgængelig. Indstil tidsgating vinduet til 0,6 til 10 nanosekunder for hver fluorescens kanal, for at undgå at opfange reflekteret lys fra glasskålen. Derefter skal du slå lys feltbilleder til og vælge detektor med lav følsomhed til dataindsamlingen.
Slå dynamisk billeddannelsestilstand til, og skru op for forstærkningen i den lyse feltkanal, indtil cellerne er tydeligt synlige. Hvis du er i fotontællingstilstand, skal du ændre området for grå værdier fra manuel til automatisk for at få vist fluorescerende signalet. Indstil Z-stakken til at afbilde hele volumenet af gærceller, og angiv billedbilledets retningsbestemthed, således at ned bevæger sig mod dækslet.
Indstil Z-trinsintervallet til 0,25 til 0,35 mikrometer for at få ca. 20 til 25 optiske sektioner pr. Z-stack, og tænd for Galvo Flowet, hvis det er tilgængeligt. For en typisk film skal du indstille tidsintervallet mellem Z-stakke til to sekunder og indstille filmens varighed til fem til 10 minutter. Gem derefter filmen som en LIF-fil.
I tilfælde af deconvolution af film skal du starte et passende deconvolution-softwareprogram, der bruger den klassiske estimeringsalgoritme med maksimal sandsynlighed, og åbne dataserien. Vælg guiden Deconvolution og parametereditoren for at bekræfte, at billedparametrene registreres og vises korrekt. Skift indlejringsmediets brydningsindekss værdi til 1,4 for at tilnærme gærcytoplasmaet.
Brug derefter editoren til at estimere dækslets position. Vælg Angiv alle bekræftede, og klik på Acceptér, og vælg Guiden Enter. Klik på den næste pil for at omgå valg af punktspredningsfunktion og beskæring af faser for behandling, og fortsæt gennem guiden deconvolution for hver fluorescenskanal.
Vælg funktionen til fysisk eller logaritmisk lodret tilknytning, og undersøg den rå datafluorescensintensitetsprofil. Angiv manuel som tilstand for baggrundsestimering, angiv en baggrundsværdi, og klik på Acceptér. Lad den maksimale iterationsværdi være 40, og indtast et anslået signal-støjforhold.
Sluk derefter for blegemiddelkorrektionen, og klik på Deconvolve. Vælg Accepter til næste kanal i deconvolution-resultatvinduet, hvis støjen fjernes tilstrækkeligt, uden at den ægte fluorescens fjernes fra de dunkle strukturer. Når alle de fluorescerende kanaler er blevet tilfredsstillende dekonvolvedet, skal du klikke på Alt gjort og arrangere den røde kanal først, efterfulgt af de grønne, blå og lyse feltkanaler, til efterfølgende redigering i ImageJ.
Gem derefter billedsekvensen som en otte-bit TIF-fil, og vælg én fil pr. kanal- og kontraststrækning som konverteringstilstand. For blegemiddel korrektion, importere de dekoncentralerede billedsekvenser i ImageJ og klik på Billede, Hyperstacks, og Stak til Hyperstack at konvertere billederne til en hyperstack. Vælg xyzct i rullemenuen, og angiv antallet af kanaler, Z-stack-udsnit og tidsrammer.
Hvis du vil rette fluorescenskanalerne til fotoblegning, skal du vælge Billede, Farve, Split Channels og for lysstofrør skal du vælge Plugins, EMBLtools, Bleach Correction og Eksponentiel pasform. Vælg derefter Billed-, farve- og fletkanaler for at flette de lyse felt- og blegemiddelkorrigeret fluorescenskanaler til en hyperstack, og gem den dekoncentralerede og blegemiddel korrigeret hyperstack til efterfølgende filmgenerering og redigering som en otte-bit TIF-fil. Hvis du vil konvertere det dekoncentralerede og blegemiddel korrigerede datasæt til en skaleret montage, skal du vælge Plugins, IJ_Plugins og Make Montage Series og vælge den relevante otte bit hyperstack.
Klik på Åbn og OK for at acceptere, at alle udsnittene bruges til at oprette montagen, og klik på OK igen for at acceptere den foreslåede skaleringsfaktorværdi. Gem den oprindelige montage som en otte bit TIF-fil og vælg Plugins, IJ_Plugins, Montage Series to Hyperstack og OK, for at skabe en 4D hyperstack fra den oprindelige montage, der omfatter alle tidsrammer. Hvis du vil generere den oprindelige forventede film med gennemsnittet, skal du først vælge Plugins, IJ_Plugins, Project Hyperstack og OK for at acceptere standardparametrene for ZProjection.
Gem den gennemsnitlige projicerede film som en otte-bit TIF-fil, og undersøg filmen for at identificere de enkelte strukturer, der kan spores i hele deres mærkningsperiode. Identifikation af en struktur, der kan spores pålideligt i filmens løbetid, og isolering af denne struktur til analyse er de mest kritiske trin i proceduren. Følg derefter instruktionerne i plugin brugervejledningen, at isolere strukturer af interesse ved at redigere montage.
Opret en 4D hyperstack fra den redigerede montage for perioden, herunder de strukturer af interesse, og gemme den redigerede hyperstack. Hvis du vil kvantificere fluorescensintensiteten over tid for den isolerede struktur i den redigerede 4D-hyperstack, skal du vælge Plugins, IJ_Plugins og Analysér redigeret film, indtaste tidsintervallet mellem Z-stakke og klikke på OK. Hvis du vil oprette en endelig film af den isolerede struktur, skal du vælge Plugins, IJ_Plugins og Project Hyperstack, angive de Z-stack-udsnit, der skal medtages, vælge Gennemsnitlig intensitet som projektionstype og klikke på OK. Hvis du vil oprette en 4D-hyperstack med de oprindelige data over de redigerede data, skal du vælge plugins, IJ_Plugins, Flet to hyperstacks og Placer først over sekundet. Hvis du vil generere en film fra 4D-hyperstack med de oprindelige data over de redigerede data, skal du vælge Plugins, IJ_Plugins og Project Hyperstack, angive de Z-stack udsnit, der skal medtages, vælge Gennemsnitlig intensitet som projektionstype og klikke på OK. Her kan den første ramme af en Z-stack projektion af rå data sammenlignes med de samme deconvolved og blegemiddel korrigerede data.
Disse rammer fra samme deconvolved og blegemiddel korrigeret film viser to cisternae, der blev analyseret, som først etiket med den grønne Vanadate modstand glycosylation protein 4 eller Vrg4 markør, og senere med den røde Secretory 7 eller Sec7 gentransport protein markør. Denne montage, skabt af en deconvolved og blegemiddel korrigeret hyperstack, viser alle de optiske sektioner på et enkelt tidspunkt før og efter redigering, for at tillade isolering af signalet fra en af de valgte cisternae. I dette tal vises flere billeder fra den endelige film af de projicerede Z-stakke med de oprindelige fremskrivninger øverst på figuren og redigerede fremskrivninger nederst.
Kvantificering af de grønne og røde fluorescerende signaler fra den valgte Golgi cisternae afslører, at den grønne Vrg4 markør ankommer og fortsætter i ca 80 sekunder, hvorefter den røde Sec7 markør ankommer og fortsætter i ca 60 sekunder, med en kort overlapning mellem de to markører. Når du udfører denne procedure, er det vigtigt at identificere strukturer, der entydigt kan spores gennem hele deres levetid. Den samme type analyse kan udføres efter at have foretaget en mutation eller en anden form for specifik hastighed.
Denne teknik har åbnet vejen for at studere den dynamiske adfærd Golgi cisternae og endoplasmatiske reticulum exit sites ved hjælp af gær som model system.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
