Kryo-elektron mikroskopisk gitter forberedelse til tid-løste undersøgelser ved hjælp af en ny robot system, Spotiton

Ved hjælp af Spotiton robotsystem, kan man blande og vitrify et protein af interesse med en interagerende partner på en elektron mikroskop gitter i så hurtigt som 90 millisekunder. Denne protokol gør det muligt at fange mellemliggende proteinbekræftelser, der er for forbigående til at blive fanget af standard gitterforberedelsesteknikker. Tid løst Spotiton kan informere sub-sekund biologiske eller biokemiske systemer såsom membran kanal aktivering, DNA eller RNA syntese, eller tidlig interaktion mellem et lægemiddel eller antistof med sit mål protein.

Brugeren skal samtidig administrere flere komponenter, der direkte påvirker kvaliteten af et gitter. Det er vigtigt at forstå systemet, før du bruger og har tålmodighed, når du forbereder gitre. Til at begynde med skal du åbne hovedventilen på nitrogenforsyningstanken og sikre, at systembeholderen er fyldt med afgasset ultrapurt vand.

Tænd computeren og Spotiton-systemet ved multi-outlet strømstriben. Klik på skrivebordsikonet for at åbne brugergrænsefladen i Spotiton-softwaren. I menuen Funktioner skal du vælge Initialiser faser for at initialisere og hjemføre de tre akserobotter og den roterende dispenserhovedsamling, så dispenserspidserne peger ned før initialisering og sporing.

Klik på Gå til sikker position i hovedmenuen for at sende robotterne til den sikre position. Vælg Prime under fanen Aspirate for at skylle dispenserhovederne flere gange med vand fra reservoiret. Fortsæt, indtil to uafbrudte vandstrømme kan ses på vej ud af spidserne.

Send tip et til inspektionskameraet under fanen Besigt, og test brandvandet, og juster amplituden, indtil der produceres diskrete dråber. Tryk på knappen Optag i den øverste kameraskærm for at optage en video med tip en fyring. Send tip to til inspektionskameraet.

Afspil videoen af tip en fyring i højre side skærmen på samme tid tip to er fyret i den øverste kamera skærm, der matcher mønsteret af dråbeproduktion fra de to dispensere. Fjern pincet fra holderen på gitterrobotten ved hjælp af den medfølgende Allen-nøgle. På en nærliggende bordplade skal du placere en testgitter nanowire side op på kanten af gitterblokken.

Tag forsigtigt gitterets rand og placer den korrekt i pincet. Så sæt pincet op igen. Klik på Tip til kamera under fanen Cryo for at flytte et tip et ind i synsfeltet for det øverste dykkurvskamera, så Live vælges på den øverste kameraskærm.

Tænd og juster det øverste kameralys. Placer spidsen en synlig i den øverste kameraskærm ved at klikke med musen i skærmen. Klik på Gitter til kamera for at placere gitteret foran det øverste kamera, og juster derefter spidsen en position igen, hvis det er nødvendigt.

Under fanen Cryo skal du sikre dig, at Vitrified Grid ikke er valgt, klik på Kømål og derefter på Dyk. Vurder de øvre og nedre billeder for at bekræfte, at dispenserne fungerer normalt. Fortynd to prøver til de ønskede koncentrationer med en passende buffer, ideelt ved hjælp af det samme for begge, og fyld cryogen skålen med flydende nitrogen.

Plasma rengør tre til fire nanowire gitre ved hjælp af fem watt brint og ilt, og 1,5 minutter som udgangspunkt. Sæt forstøveren i, og hold øje med, at dampen kommer ud af den centrale port på forstøverhætten. Overhold skærmen med levende fugtighed i hovedvinduet, eller åbn sporingen af omgivende luftfugtighed under Rapporter og Ambient.

Kontroller luftfugtigheden i kammeret og ligklædezonerne. Der tilsættes fem mikroliter af hver prøve i prøvekopperne. Læg prøvekopperne i holdebakken med en prøve til tip en til venstre og til tip to til højre.

Skub derefter bakken tilbage i maskinen, indtil den sidder. Vælg tre mikroliter under fanen Aspirate for den diskenhed, der skal aspireres af hvert tip. Sørg for, at prøvebakken sidder sikkert, klik på Aspirate, og hold øje med, at pipettestadiet flytter dispenserhovederne ind i prøvekopperne.

Kontroller, at begge prøver er vellykket, ved at udtage prøvekopperne og observere et fald i væskeniveauet. Send hvert tip til inspektionskameraet under fanen Undersøg for at bekræfte uhindret dispensering. Juster amplituden efter behov for at matche dråbedannelsen fra hvert tip.

Læg et frisk plasmarenset gitter i pincet, men monter ikke pincet endnu. Sørg for, at fugtighedsniveauet er forhøjet til ca. 90 til 95%Fyld ethanbægeret, og udfør en sidste testbrand af begge spidser foran inspektionskameraet, hvilket bekræfter ingen hindring. Klik på Tip til kamera under fanen Cryo.

Tjek ethan kop. Hvis ethanisen er dannet, smelte efter behov med yderligere ethangas. Monter pincet med gitteret på gitterstadiet.

Klik på Gitter til kamera under fanen Cryo for at sikre, at tip et er placeret korrekt i den øverste kameraskærm. Klik på Vitrified Grid, Kø target, derefter Springet. Klik på OK, når du bliver bedt om at befale gitterrobotten at hoppe gitteret fra ethan til flydende nitrogen og frigive det på den nedsænkede hylde.

Undersøg billeder af gitteret for at afgøre, om det skal opbevares eller kasseres. Hvis du holder gitteret, skal du forkøle fintspidsede sammenkrøpper, forsigtigt gribe gitteret ved kanten og placere det i en gitterboksplads, startende med den første plads til venstre for hakket og gå med uret. Brug Eksperimentfremviseren til at gennemse og sammenligne gitterbillederne fra de øverste og nederste kameraer sammen med maskinens indstillinger og fugtighedsmålinger på tidspunktet for springet ved at vælge Rapporter og Eksperiment.

Billeder af gitre udarbejdet under en enkelt tid løst Spotiton session ved at blande RNA polymerase i en 105 base par DNA oligomer transporterer en promotor sekvens for 150 millisekunder før vitrifikation er vist her. Af de seks gitre er der kun ét, der viser suboptimal wicking. Mønsteret af isaflejring på et vitrified gitter passer tæt sammen med mønsteret af deponeret væske set i det øverste kamera billede.

Effektiv wicking af de blandede prøver forekommer langs nanowire dækket gitter barer, hvor prøven sjældent overløb i firkanter støder op til dem, hvor det landede. I isfyldte firkanter er isen typisk tykkest inden for huller i midten af pladsen og bliver tyndere i huller tættere på gitterstængerne. Huller umiddelbart ved siden af gitterstængerne er ofte tomme på grund af nærhed til nanowirerne.

Korrekt forberedelse og håndtering af nanowiregitrene sikrer god istykkelse på blandede prøvegitre. Spotiton-systemet giver også brugeren mulighed for at deponere de to prøver separat på et enkelt gitter, hvilket gør det muligt at samle en ublandet kontrol under den samme gittervedligeholdelsessession. Spotiton har gjort det muligt at fange de første mellemprodukter i bakterielle genekspression i realtid.

Fordi de dannes på en tidsskala under andet, har deres strukturer været ukendte indtil nu.