Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Meksika Cavefish işlevinde Gene manipülasyon
Chapters
Summary April 22nd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Evrimsel modeli sistem Astyanax mexicanusgenler manipülasyon yaklaşımları açıklar. Üç farklı teknikler açıklanmıştır: Tol2-aracılı transgenesis, CRISPR/Cas9 ve nakavt morpholinos kullanarak ifade kullanarak genom hedeflenen manipülasyon. Bu araçları doğrudan soruşturma yüzey ve mağaralarda yaşayan biçimler arasında varyasyon yatan genlerin kolaylaştıracaktır.
Transcript
Mağara hayvanları çeşitli morfolojik, gelişimsel ve davranışsal özellikleri araştırmak için zorlayıcı bir sistem sağlar. Ama bu model sisteminin kurulmasında sınırlayıcı faktörlerden biri gen fonksiyonlarını manipüle etmemizi sağlayacak genetik araçların eksikliğidir. Burada Meksika mağara balığı Astyanax mexicanus'ta gen fonksiyonlarını manipüle etmek için üç farklı yaklaşım gösteriyoruz.
Bu araçlar, yüzey balıkları ve mağara balıkları arasındaki doğal varyasyonların altında yatan genlerin ve bunların fenotiplerle nasıl ilişkili olduğunu araştırmanızı sağlayacaktır. Bethany Stahl, laboratuvarımda yetenekli bir doktora sonrası bu prosedürü gösterecek. İşleme başlamadan önce, 100 mililitrelik Petri kabını balık sistemi suyunda çözünmüş sıcak %3 agarose ile doldurun ve kalıbın altında ki havayı yakalamamak için kalıbı yavaşça agarose'a indirmeden önce agarose'a dikkatlice bir yumurta enjeksiyon kalıbı yerleştirin.
Agarose katılaşmış olduğunda, dikkatlice kalıp çıkarın ve bir hafta kadar dört derece santigrat plaka saklayın. Daha sonra borosilikat cam kılcal damarlardan iğneleri ve üreticinin yönergelerine göre bir elektrot iğnesi çekmecesini çekin. Enjeksiyon günü, tek hücreli yumurtaları enjeksiyon plakasına aktarmak için cam bir pipet kullanın, enjeksiyon plakasının beş sırasını satır başına 30 ila 40 yumurta ile doldurun.
Balık sistemi su küçük bir miktar ile sulu yumurta tutun. Buz üzerinde Morpholino'yu eritin ve enjeksiyon çözeltisini hazırlayın, böylece 400 pikogram Morpholino yumurta başına uzun bir Microloader pipet ucu kullanılarak veya sonuna iki ila dört mikrolitre lik bir bolu ekleyerek enjekte edilir. Tüm iğneler yüklendiğinde, enjeksiyon iğne uçlarından fazla uzunluğu kesmek için forcep kullanın ve ilk iğneyi pikolitre mikroenjektöre bağlı bir mikromanipülatöre monte edin.
Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında enjeksiyon çanak yerleştirin ve doğrudan sarısı içine Morpholino enjeksiyon çözeltisi bir nanolitre enjekte etmeden önce iğne ile her yumurta nüfuz mikromanipülatör kullanın. CRISPR enjeksiyonu için, 25 pikogram kılavuz RNA'yı CRISPR ile ilişkili protein 9 messenger RNA'nın 300 pikogramı ile karıştırın ve ortaya çıkan RNA çözeltisinin iki nanolitresini gösterildiği gibi her embriyoya enjekte edin. Tol2 transposaz ve Tol2 kanatlı plazmid enjeksiyonu için, Tol2 messenger RNA'nın mikrolitre başına 25 nanogramını Tol2 plazmid yapının mikrolitresine 25 nanogram ve RNase içermeyen suda fenol kırmızısı ile birleştirin.
Sonra her embriyoya az önce gösterildiği gibi bir nanolitre çözelti enjekte edin. Morpholino enjekte edilen hayvanları enjeksiyondan dört gün sonra, ilgi genine bağlı olarak taramak için, balık larvalarını stereo mikroskop altında görselleştirerek enjekte edilen hayvanların fenotipini veya davranışı ölçmek için video kaydını gözlemleyin. CRISPR indels için tarama için, PCR tüpler içine CRISPR enjekte embriyolar transfer ve polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR analizi için standart DNA çıkarma protokolleri uyarınca DNA ayıklamak.
Mutagenez değerlendirmek için, üç saat boyunca 70 volt bir% 3 agarose jel pcr ürün beş mikrolitre çalıştırın. Yabani tip, mutajenize olmayan DNA farklı bir bantla sonuçlanırken mutant DNA smeary bandıile sonuçlanır. Mağara Bir mexicanus bir kontrol Morpholino ile enjekte önemli ölçüde daha fazla lokomotor aktivite sergiler ve 24 saatlik bir süre içinde azaltılmış uyku, bir şifreli Morpholino ile enjekte yüzey balık ile karşılaştırıldığında.
Hipokretin oreksin Morpholino enjeksiyonu kontrol enjekte balık ile karşılaştırıldığında yüzey balık uyku üzerinde çok az etkisi vardır. Buna karşılık, Morpholino enjeksiyonu ile hipokretin oreksin nakavt mağara da yaşayan balık uyku üzerinde önemli bir etkisi vardır, hipokretin oreksin ekspresyonu ve uyku kaybı arasında doğrudan bir bağlantı sağlayan. Yüzey balıklarında albinizm geni OCA2'nin CRPSR aracılı mutagenezi bazı bireylerin yabani tip OCA2 pozitif alel için homozigot olarak sonuçlanmasına neden olur ve pigmentasyon barındırma ile ilişkilidir, OYSA CRISPR mutasyona uğramış OCA2 negatif alelin iki kopyasına sahip bireyler albinodur, mağara balıklarında mutant OCA2 geni ile albinizm arasında doğrudan bir bağlantı sağlar.
Kararlı F1 çizgileri oluşturmak için tol2 iletilmiş transgeni niçin yabani tipe arkadan çapraz olarak F0 pozitif'ini seçin. Bu, nöronal aktivitedeki farklılıkları ortaya çıkarmak, mağara ortamındaki davranış değişikliklerine aracılık etmek, a mexicanus'taki gen fonksiyonunu karakterize etmek ve işlemek için birçok ek transgenin ekspresyonuna zemin hazırlamak için canlı kalsiyum görüntülemeyi sağlar. Hatırlanması gereken en önemli şey yumurtaları sıkıca tabağa yüklemek, iğneyi düzgün kesmek ve mikroenjeksiyonu optimize etmektir.
Başarılı bir genetik nakavt, transgen entegrasyonu veya CRISPR aracılı gen düzenleme sonra, bu balık gelişimsel, davranışsal ve beyin aktivitesi analizleri için kullanılabilir.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
