Winning van extracellulaire blaasjes uit hele weefsel

Dit protocol biedt een rigoureuze en reproduceerbare techniek voor extractie en isolatie van kleine extracellulaire vikjes uit hele weefselmonsters voor downstream ex-vivo analyses. Met een van de hoogste niveaus van zuiverheid momenteel haalbaar, deze methode vergemakkelijkt de directe morfologische, immunophenotypische, en diepe karakterisering van interstitiële sicles uitgescheiden in verschillende weefselmonsters, met inbegrip van tumoren. Hier tonen we de isolatie van weefsel-EV’s van hersen- en longtumormonsters.

Echter, deze techniek kan worden toegepast op studies met behulp van diverse, goedaardige, of andere tumor exemplaren ook. Om te beginnen, bereid 10 milliliter dissociatiebuffer in Hibernate-E medium voor elke 0,4 tot 1,0 gram weefsel. Voeg geheel vers of bevroren weefsel aan de buffer in een 50 milliliter buis, en incubeer in een warm water bad op 37 graden Celsius gedurende 20 minuten.

Voeg hierna protease- en fosforremmers toe voor een laatste 1xconcentratie in de dissociatiebuffer. Giet de oplossing met het weefsel in een losse pasvorm downs homogenizer. Gebruik ongeveer 30 langzame slagen per monster om het weefsel voorzichtig te scheiden.

Breng vervolgens het gescheiden weefsel en de bufferoplossing over op een conische buis van 50 milliliter. Centrifuge op 500x g en op vier graden Celsius gedurende vijf minuten om de cellen en de resterende vezels of samenhangende weefselfragmenten pellet. Breng de supernatant naar een schone 50 milliliter conische buis, en centrifuge op 2, 000x g en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten te pelleteren en gooi de grote cellulaire puin.

Breng deze supernatant over op een schone conische buis van 50 milliliter en centrifuge op 10,000x g en bij vier graden Celsius gedurende 40 minuten om ongewenste grotere milsicles of kleine apoptotische lichamen te pelleteren. Decanteer de supernatant door een 0,45 micrometer filter in een schone 12 milliliter ultracentrifugatiebuis. Vervolgens ultracentrifuge het monster op 100, 000x g en op vier graden Celsius gedurende twee uur, om kleine EV’s pellet.

Decanteer de supernatant en laat de ultracentrifugatiebuizen vijf tot tien minuten omgekeerd, waarbij vaak wordt getapt om eventuele restvloeistof aan de zijkanten van de buizen te verwijderen. Dan, resuspend de EV pellet in 1,5 milliliter van 0,25 molaire sacharose buffer. Bedek de buizen met Parafilm, en dan vortex de EV’s in oplossing.

Rock de ultracentrifugebuizen 10 tot 15 minuten op kamertemperatuur. En dan nog een keer vortex. De buizen kort centrifugeren met een snelheid van minder dan 1,000x g om de vloeibare suspensie aan de onderkant van de buis terug te krijgen.

Bewaar indien nodig de vering ‘s nachts op vier graden Celsius. Voeg eerst 1,5 milliliter 60%iodixanol toe aan de 1,5 milliliter van de sacharose tris buffer die de EV’s bevat om een definitieve oplossing te creëren die 30%iodixanol bevat. Pipet meerdere malen op en neer om de oplossing grondig te mengen.

Breng deze oplossing naar de bodem van een 5,5 milliliter ultracentrifugatiebuis. Meng vervolgens de 60%iodixanol voorraad met ultra zuiver water om ten minste 1,5 milliliter van zowel een 20% als een 10%iodixanol oplossing voor te bereiden. Met behulp van een spuit en een 18-meter naald meet je 1,3 milliliter van de 20%iodixanol-oplossing en leg je deze voorzichtig op de onderste helling.

Houd de schuine kant van de naald in contact met de binnenkant van de buis, net boven de meniscus en voeg de oplossing drop verstandig om te voorkomen dat het mengen van de lagen op de dichtheid interface. Dan, laag 1,2 milliliter van de 10%iodixanol oplossing op de top van de 20%-laag, met behulp van dezelfde techniek. Breng de ultracentrifugatiebuizen zorgvuldig in balans en laad in rotoremmers.

Stel de acceleratie- en vertragingssnelheden van een zwenkbakrotor in op de minimale snelheden en zet 50 minuten op 268, 000x g en op vier graden Celsius. Terwijl het monster wordt gecentrifugeerd, label 10 1,5 milliliter microcentrifuge buizen voor elk monster dat zal overeenkomen met fracties een tot en met 10 van de dichtheid gradiënt. Zodra de centrifugatie is voltooid, verwijder voorzichtig de buizen uit de rotoremmers en plaats ze in een stabiele houder.

Pipette 10 seriële fracties van 490 microliters vanaf de bovenkant van het verloop in de overeenkomstige buizen. Met behulp van een refractometer meet u de brekingsindexen van de breuken. Breng vervolgens elke fractie over naar een schone ultracentrifugatiebuis van 12 milliliter.

Voeg vijf milliliter 1x PBS toe aan elke buis en pipet langzaam op en neer om te mengen. Voeg nog eens zes milliliter 1x PBS toe aan de bovenkant van de buis en meng voorzichtig opnieuw. Ultracentrifuge de buizen op 100, 000x g en bij vier graden Celsius om de kleine adergels opnieuw te pelleteren.

Decanteer de supernatant en tik de buizen droog voordat de vesicles worden gelysing voor eiwitanalyse of de EV’s opnieuw in gebruik worden gehouden voor morfologische analyse. Om de EV’s voor eiwitanalyse te lyse, voeg 40 microliter sterke lysisbuffer met proteaseremmer toe aan de EV-pellets. Plaats Parafilm over elke buis, en vortex krachtig.

Vervolgens, rock de buizen voor 20 minuten op kamertemperatuur en vortex weer. Het monster gedurende 30 tot 60 seconden kort centrifugeren op 1, 000x g om het volledige monstervolume te herstellen. Breng elk monster over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter en bewaar het op een temperatuur tussen de 20 en 80 graden Celsius tot ze klaar zijn voor verdere verwerking.

Om de gezuiverde lysaten voor te bereiden op immunoblot-analyse, voegt u 5x Laemmli monsterbuffer toe aan de monsters voor een uiteindelijke concentratie van 1x. Kook het monster op 95 graden celsius gedurende vijf tot 10 minuten. Laad vervolgens een gelijk volume van fracties één tot en met 10 in een 10%SDS-paginagel.

Laad een gelijke massa weefselhomogenaat. Voer elektroforese en westerse vlekanalyse uit om EV-eiwitten in de gezuiverde lysates te bevestigen en relatieve EV-overvloed in fracties te vergelijken. In deze studie worden extracellulaire akelige akelige akeligheden geëxtraheerd en gezuiverd uit hele weefsel.

Na ultracentrifugatie van de 10 tot 30% iodixanol gradiënt, een populatie van lichte EV’s kan worden gezien migreren tot fractie twee, terwijl een populatie van dichte EV’s kan worden gezien migreren tot fractie vijf, afhankelijk van het weefsel type. Representatieve immunoblots van de gradiëntfracties vertonen de efficiënte scheiding en zuivering van kleine tumor afgeleide EV’s in fractie vijf. Met name longtumor exemplaren lijken verrijkt in dichte EV’s in vergelijking met lichte EV’s die eerder werden geoogst uit hele hersenweefsel.

Representatieve nanodeeltjes tracking analyse en elektronenmicroscopie van weefsel-afgeleide blaasjes in de overheersende blaasjes bevattende fractie tonen de verrijking en het behoud van hele blaasjes. In overeenstemming met de bekende grootte en structuur van kleine EV’s. Interstitiële EV’s vertegenwoordigen veelbelovende doelen voor de ontwikkeling van nieuwe diagnostische of prognostische biomarkertesten.

Deze techniek biedt onderzoekers tools voor de extractie en zuivering van vesicles voor downstream utility. Na extractie van hele of lysed weefsel-EV’s kan een brede karakterisering van vesicles worden uitgevoerd, waaronder proteomische, genomische en lipidomische analyses. Bovendien kunnen monsters worden gebruikt voor meer gerichte benaderingen.

Vesicles die rechtstreeks uit weefselmonsters zijn geïsoleerd, kunnen verder inzicht geven in ziektemechanismen, waaronder tumorverwekkende ontstaan, en kunnen in de toekomst belangrijke diagnostische of prognostische hulpmiddelen bieden.