Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
מיצוי של שלפוחית חוץ-תאית מרקמות כל
Chapters
Summary February 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שלפוחית חוץ-תאית קטנה (EVs) של כל הרקמות, כולל דגימות המוח ואת הגידול. שיטה זו מציעה שיטה לשחזור כדי לחלץ EVs מרקמות מוצק עבור נוסף במורד הזרם ניתוחים.
Transcript
פרוטוקול זה מספק טכניקה קפדנית לשחזור עבור מיצוי ובידוד של גירויים חוץ תאיים קטנים מדגימות רקמה שלמה עבור ניתוחים במורד הזרם לשעבר vivo. עם בין הרמות הגבוהות ביותר של טוהר כיום בר השגה, שיטה זו מקלה על מורפולוגי ישיר, immunophenotypic, ואפיון עמוק של גירויים ביניים המופרשים לתוך דגימות רקמה שונות, כולל גידולים. כאן, אנו מדגימים את הבידוד של כלי רכב חשמליים רקמה מדגימות גידול במוח ובריאות.
עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים באמצעות מגוון, שפיר, או דגימות גידול אחרות גם כן. כדי להתחיל, להכין 10 מיליליטר של חיץ דיסוציאציה ב Hibernate-E בינוני עבור כל 0.4 כדי 1.0 גרם של רקמה. מוסיפים רקמה טרייה או קפואה שלמה למאגר בצינור של 50 מיליליטר, וגוררים באמבט מים חמים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
לאחר מכן, מוסיפים מעכבי פרוטאז ופוספטאז לריכוז 1x הסופי במאגר הדיסוציאציה. יוצקים את הפתרון עם הרקמה לתוך התאמה רופפת downs homogenizer. השתמש כ 30 משיכות איטיות לכל מדגם כדי לנטרל בעדינות את הרקמה.
לאחר מכן, להעביר את הרקמה דיסוציאציה פתרון חיץ לצינור חרוט 50 מיליליטר. צנטריפוגה ב 500x גרם וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי גלולה את התאים ואת הסיבים הנותרים או שברי רקמה מגוונים. מעבירים את העל-טבעי לצינור חרוט נקי של 50 מיליליטר, ולצנטריפוגה ב-2,000x גרם וב-4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לסלק ולהשליך את הפסולת התאית הגדולה.
מעבירים את העל-טבעי הזה לצינור חרוט נקי של 50 מיליליטר, ולצנטריפוגה ב-10, 000x g וב-4 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי לסלק וריצים גדולים יותר או גופים אפופטיים קטנים. Decant supernatant דרך מסנן מיקרומטר 0.45 לתוך צינור אולטרה צנטריפוגה נקי 12 מיליליטר. לאחר מכן, ultracentrifuge את המדגם ב 100, 000x g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעתיים, כדי גלולה כלי רכב חשמליים קטנים.
Decant את supernatant ולהשאיר את צינורות ultracentrifugation הפוך במשך חמש עד 10 דקות, הקשה לעתים קרובות כדי להסיר כל נוזל שיורית בצידי הצינורות. לאחר מכן, לחץ מחדש את גלולת EV ב 1.5 מיליליטר של 0.25 חיץ סוכרוז טוחנת. מכסים את הצינורות עם Parafilm, ולאחר מכן מערבולת כלי רכב חשמליים לפתרון.
רוק צינורות אולטרהצנטריפוגה במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר. ואז מערבולת פעם נוספת. בקצרה צנטריפוגה הצינורות במהירות פחות מ 1, 000x g כדי לשחזר את המתלה הנוזלי בתחתית הצינור.
במידת הצורך, לאחסן את ההשעיה בארבע מעלות צלזיוס לילה. ראשית, להוסיף 1.5 מיליליטר של 60% יודיקסנול 1.5 מיליליטר של מאגר טריס סוכרוז המכיל את כלי רכב חשמליים כדי ליצור פתרון סופי המכיל 30%יודיקסנול. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב את הפתרון ביסודיות.
העבר פתרון זה לתחתית צינור אולטרה-מרכז 5.5 מיליליטר. לאחר מכן, מערבבים את מניית יודיקסנול 60% עם מים טהורים במיוחד כדי להכין לפחות 1.5 מיליליטר של 20% ופתרון יודיקסנול של 10%. באמצעות מזרק ומחט 18 מד, למדוד 1.3 מיליליטר של פתרון 20% iodixanol בזהירות שכבה אותו על גבי שיפוע התחתון.
שמור על שפוע המחט במגע עם החלק הפנימי של הצינור, ממש מעל המניסקוס ולהוסיף את הפתרון טיפה חכם, כדי למנוע ערבוב השכבות בממשק הצפיפות. לאחר מכן, שכבה 1.2 מיליליטר של פתרון 10%iodixanol על גבי 20% שכבה, באמצעות אותה טכניקה. בזהירות לאזן ולהעמיס את צינורות אולטרה צנטריפוגה לתוך דליי רוטור.
הגדר את מהירויות ההאצה וההאטה של רוטור דלי נדנדה לתעריפים המינימליים, וצנטריפוגה ב 268, 000x g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 50 דקות. בעוד המדגם הוא להיות צנטריפוגה, תווית 10 1.5 צינורות microcentrifuge מיליליטר עבור כל מדגם שיתאים שברים אחד עד 10 של שיפוע הצפיפות. לאחר השלמת הצנטריפוגה, מוציאים בעדינות את הצינורות מדליי הרוטור ומציבים אותם במחזיק יציב.
פיפטה 10 שברים סדרתיים של 490 מיקרוליטרים מהחלק העליון של המילוי לתוך הצינורות המתאימים. באמצעות מד שבירה, למדוד את האינדקסים שבירה של שברים. לאחר מכן, להעביר כל שבר לצינור נקי 12 מיליליטר אולטרהצנטריות.
הוסף חמישה מיליליטר של 1x PBS לכל צינור פיפטה למעלה ולמטה לאט לערבב. מוסיפים שישה מיליליטר נוספים של PBS 1x לראש הצינור, ומערבבים בזהירות שוב. Ultracentrifuge הצינורות ב 100, 000x גרם וב ארבע מעלות צלזיוס כדי לסלק מחדש את הווסיקלים הקטנים.
דקאנט את supernatant והקש על הצינורות יבשים לפני lysing את הווסיקים לניתוח חלבון או reresuspending כלי רכב חשמליים לניתוח מורפולוגי. כדי lyse כלי רכב חשמליים לניתוח חלבון, להוסיף 40 microliters של חיץ תזה חזקה המכיל מעכב פרוטאז כדורי EV. מניחים פרפילם מעל כל צינור, ומערבולת במרץ.
לאחר מכן, לטלטל את הצינורות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר ומערבולת שוב. בקצרה צנטריפוגה המדגם ב 1, 000x g במשך 30 עד 60 שניות כדי לשחזר את נפח המדגם כולו. מעבירים כל דגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 1.5 מיליליטר, ומאחסנים אותו בטמפרטורה שבין 20 ל-80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לעיבוד נוסף.
כדי להכין את lysates מטוהרים לניתוח immunoblot, להוסיף מאגר מדגם 5x Laemmli לדגימות לריכוז סופי של 1x. מרתיחים את המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, טען נפח שווה של שברים אחד עד 10 לתוך ג'ל דף 10%SDS.
לטעון מסה שווה של הומוגנית רקמות. בצע אלקטרופורזה וניתוח כתם מערבי כדי לאשר חלבוני EV lysates מטוהרים ולהשוות שפע EV יחסי בשברים. במחקר זה, צמחים חוץ תאיים מופצים ומטוהרים מרקמות שלמות.
לאחר אולטרהצנטריפוגה של 10 עד 30% שיפוע יודיקסנול, ניתן לראות אוכלוסייה של כלי רכב חשמליים קלים נודדים עד שבר שני, בעוד אוכלוסייה של כלי רכב חשמליים צפופים ניתן לראות נודד עד שבר חמש, בהתאם לסוג הרקמה. immunoblots נציג של שברים הדרגתיים להפגין הפרדה יעילה וטיהור של גידול קטן נגזר כלי רכב חשמליים בשבריר חמש. יש לציין, דגימות גידול ריאות מופיעים מועשרים כלי רכב חשמליים צפופים לעומת כלי רכב חשמליים קלים שנקטפו בעבר מרקמה מוחית שלמה.
ניתוח מעקב חלקיקי ננו מייצג ומיקרוסקופ אלקטרונים של וריסקים שמקורם ברקמות בווסיקל השולט המכיל שבר מדגימים את ההעשרה והשימור של וריסקים שלמים. עולה בקנה אחד עם הגודל והמבנה הידועים של כלי רכב חשמליים קטנים. כלי רכב חשמליים Interstitial מייצגים מטרות מבטיחות לפיתוח בדיקות סמן ביולוגי אבחון או פרוגנוסטיות חדשניות.
טכניקה זו מספקת לחוקרים כלים לחילוץ וטיהור של וויסיקים עבור השירות במורד הזרם. לאחר החילוץ של כלי רכב חשמליים של רקמות שלמות או lysed, אפיון רחב של ווסיקים כולל ניתוחים פרוטומיים, גנומיים וליפידומיים עשוי להתבצע. בנוסף, ניתן להשתמש בדוגמאות לגישות ממוקדות יותר.
סיקלים מבודדים ישירות מדגימות רקמה יכולים לספק תובנה נוספת על מנגנוני המחלה, כולל בראשית הגידול, ועשויים לספק כלים אבחוניים או פרוגנוסטיים חשובים בעתיד.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
