Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
पूरे ऊतक से Extracellular बुलबुले के निष्कर्षण
Chapters
Summary February 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
यहां, हम मस्तिष्क और ट्यूमर नमूनों सहित पूरे ऊतकों से छोटे extracellular बुलबुले (ईवीएस) को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस विधि को आगे बहाव के विश्लेषण के लिए ठोस ऊतक से ईवीएस निकालने के लिए एक reproducible तकनीक प्रदान करता है ।
Transcript
यह प्रोटोकॉल डाउनस्ट्रीम एक्स-वीवो विश्लेषणों के लिए पूरे ऊतक नमूनों से छोटे बाह्राशदार वेसिकल्स के निष्कर्षण और अलगाव के लिए एक कठोर और प्रजनन योग्य तकनीक प्रदान करता है। वर्तमान में प्राप्त शुद्धता के उच्चतम स्तर के बीच, यह विधि ट्यूमर सहित विभिन्न ऊतक नमूनों में स्रावित इंटरस्टिशियल वेसिकल्स के प्रत्यक्ष मॉर्फोलॉजिक, इम्यूनोफेनोटिपिक और गहरे लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करती है। यहां, हम मस्तिष्क और फेफड़ों के ट्यूमर के नमूनों से ऊतक EVs के अलगाव का प्रदर्शन करते हैं ।
हालांकि, इस तकनीक को विविध, सौम्य या अन्य ट्यूमर नमूनों का उपयोग करके अध्ययनों पर भी लागू किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, हर 0.4 से 1.0 ग्राम ऊतक के लिए हाइबरनेट-ई माध्यम में 10 मिलीलीटर वियोजन बफर तैयार करें। एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में बफर के लिए पूरे ताजा या जमे हुए ऊतक जोड़ें, और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म पानी स्नान में इनक्यूबेट।
इसके बाद, वियोजन बफर में अंतिम 1x एकाग्रता के लिए प्रोटीज और फॉस्फेटे अवरोधक जोड़ें। ऊतक के साथ समाधान को ढीले फिट डाउन होमोजेनाइजर में डालें। ऊतक को धीरे-धीरे अलग करने के लिए प्रति नमूना लगभग 30 धीमे स्ट्रोक का उपयोग करें।
फिर, 50 मिलीलीटर शंकु नली में अलग ऊतक और बफर समाधान स्थानांतरित करें। 500x जी पर सेंट्रलाइज और कोशिकाओं और शेष फाइबर या एकजुट ऊतक टुकड़े को गोली मारने के लिए पांच मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर। सुपरनेट को एक साफ 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें, और 2, 000x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और 10 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर गोली दें और बड़े सेलुलर मलबे को त्याग दें।
इस सुपरनेटेंट को एक साफ 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें, और 10, 000x ग्राम पर सेंट्रलाइज करें और किसी भी अवांछित बड़े वेसिकल्स या छोटे एपोप्टोटिक निकायों को गोली मारने के लिए 40 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर। एक साफ 12 मिलीलीटर अल्ट्रासेंट्रफ्यूजन ट्यूब में 0.45 माइक्रोमीटर फिल्टर के माध्यम से सुपरनेटेंट को डिकंट करें। इसके बाद, छोटे ईवी को गोली मारने के लिए 100, 000x ग्राम और चार डिग्री सेल्सियस पर चार डिग्री सेल्सियस पर नमूना अल्ट्रासेंट्रफ्यूज करें।
सुपरनेट को डिकेंट करें और ट्यूबों के किनारों पर किसी भी अवशिष्ट तरल को हटाने के लिए अक्सर टैप करते हुए, पांच से 10 मिनट के लिए उल्टे अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन ट्यूब छोड़ दें। फिर, 0.25 मोलर सुक्रोज बफर के 1.5 मिलीलीटर में ईवी गोली को फिर से खर्च करें। पैराफिल्म के साथ ट्यूबों को कवर करें, और फिर ईवीएस को समाधान में भंवर दें।
कमरे के तापमान पर 10 से 15 मिनट के लिए अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों रॉक। और फिर भंवर एक बार और। ट्यूब के नीचे तरल निलंबन को ठीक करने के लिए 1, 000x ग्राम से कम गति से ट्यूबों को संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें।
यदि आवश्यक हो, तो निलंबन को रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। सबसे पहले, सुक्रोज ट्राइस बफर के 1.5 मिलीलीटर में 60% iodixanol के 1.5 मिलीलीटर जोड़ें जिसमें ईवीएस शामिल है जिसमें 30% आयडिक्सनॉल युक्त अंतिम समाधान बनाने के लिए शामिल है। समाधान को अच्छी तरह से मिलाने के लिए कई बार ऊपर और नीचे पिपेट करें।
इस समाधान को 5.5 मिलीलीटर अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन ट्यूब के नीचे स्थानांतरित करें। इसके बाद, 60% iodixanol स्टॉक को अल्ट्रा शुद्ध पानी के साथ मिलाएं ताकि 20% और 10% आयडिक्सनॉल समाधान दोनों के कम से कम 1.5 मिलीलीटर तैयार किया जा सके। एक सिरिंज और एक 18 गेज सुई का उपयोग करना, 20% iodixanol समाधान के १.३ मिलीलीटर उपाय और ध्यान से यह नीचे ढाल के शीर्ष पर परत ।
सुई के बेवेल को मेनिस्कस के ठीक ऊपर ट्यूब के अंदर के संपर्क में रखें और घनत्व इंटरफेस पर परतों को मिलाने से बचने के लिए समाधान ड्रॉप वार जोड़ें। फिर, एक ही तकनीक का उपयोग करते हुए, 20% परत के शीर्ष पर 10% iodixanol समाधान के 1.2 मिलीलीटर परत। ध्यान से संतुलन और रोटर बाल्टी में अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन ट्यूब लोड।
न्यूनतम दरों के लिए एक स्विंग बाल्टी रोटर की त्वरण और मंदी की गति निर्धारित करें, और 268, 000x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और 50 मिनट के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर। जबकि नमूना अपकेंद्रित्र किया जा रहा है, प्रत्येक नमूने के लिए 10 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब लेबल जो घनत्व ढाल के 10 के माध्यम से एक अंशों के अनुरूप होगा। एक बार अपकेंद्री पूरा हो जाने के बाद, धीरे-धीरे रोटर बाल्टी से ट्यूबों को हटा दें और उन्हें एक स्थिर धारक में रखें।
पिपेट 490 माइक्रोलीटर के 10 सीरियल अंश ढाल के ऊपर से संबंधित ट्यूबों में। अपवर्तक प्रकारोमीटर का उपयोग करके, अंशों के अपवर्तक सूचकांकों को मापें। फिर, प्रत्येक अंश को एक साफ 12 मिलीलीटर अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
प्रत्येक ट्यूब में 1x पीबीएस के पांच मिलीलीटर जोड़ें और मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पिपेट करें। ट्यूब के शीर्ष पर 1x PBS के एक अतिरिक्त छह मिलीलीटर जोड़ें, और ध्यान से फिर से मिश्रण । अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों को 100, 000x ग्राम पर और चार डिग्री सेल्सियस पर छोटे वेसिकल्स को फिर से गोली मारने के लिए।
सुपरनेट को डिकेंट करें और प्रोटीन विश्लेषण के लिए वेसिकल्स को बाहर निकालने या मॉर्फोलॉजिक विश्लेषण के लिए ईवीएस को फिर से खर्च करने से पहले ट्यूबों को सूखा टैप करें। प्रोटीन विश्लेषण के लिए ईवीएस को लाइसे करने के लिए, ईवी छर्रों में प्रोटीज अवरोधक युक्त मजबूत लाइसिस बफर के 40 माइक्रोलीटर जोड़ें। प्रत्येक ट्यूब पर पैराफिल्म रखें, और भंवर जोरदार ढंग से।
इसके बाद, कमरे के तापमान और भंवर में फिर से 20 मिनट के लिए ट्यूबों रॉक । पूरे नमूने की मात्रा को ठीक करने के लिए 30 से 60 सेकंड के लिए 1, 000x ग्राम पर नमूना संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें। प्रत्येक नमूने को एक नए 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, और इसे आगे की प्रक्रिया के लिए तैयार होने तक 20 और 80 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान पर स्टोर करें।
इम्यूनोब्लॉट विश्लेषण के लिए शुद्ध लाइसेट्स तैयार करने के लिए, 1x की अंतिम एकाग्रता के लिए नमूनों में 5x लेम्मली नमूना बफर जोड़ें। सैंपल को पांच से 10 मिनट तक 95 डिग्री सेल्सियस पर उबाल लें। फिर, 10% एसडीएस पेज जेल में 10 के माध्यम से अंशों की बराबर मात्रा लोड करें।
ऊतक समरूप के बराबर द्रव्यमान लोड करें। शुद्ध lysates में EV प्रोटीन की पुष्टि करने के लिए इलेक्ट्रोफोरेसिस और पश्चिमी दाग विश्लेषण करें और अंशों में सापेक्ष EV बहुतायत की तुलना करें। इस अध्ययन में, एक्सट्रासेलुलर वेसिकल्स को पूरे ऊतक से निकाला और शुद्ध किया जाता है।
10 से 30% iodixanol ढाल के अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के बाद, प्रकाश ईवीएस की आबादी को दो अंश तक माइग्रेट करते हुए देखा जा सकता है, जबकि घने ईवीएस की आबादी को ऊतक प्रकार के आधार पर अंश पांच तक माइग्रेट करते हुए देखा जा सकता है । ढाल अंशों के प्रतिनिधि इम्यूनोब्लॉट्स अंश पांच में छोटे ट्यूमर व्युत्पन्न ईवीएस के कुशल जुदाई और शुद्धिकरण को प्रदर्शित करते हैं। विशेष रूप से, फेफड़ों के ट्यूमर के नमूने हल्के ईवीएस की तुलना में घने ईवीएस में समृद्ध दिखाई देते हैं जो पहले पूरे मस्तिष्क के ऊतकों से काटे गए थे।
प्रतिनिधि नैनो कण ट्रैकिंग विश्लेषण और ऊतक व्युत्पन्न वेसिकल्स के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में अंश युक्त पूरे वेसिकल्स के संवर्धन और संरक्षण को प्रदर्शित करता है। ज्ञात आकार और छोटे ईवी की संरचना के अनुरूप। इंटरस्टिशियल ईवीएस उपन्यास नैदानिक या शकुन बायोमार्कर परख के विकास के लिए आशाजनक लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं।
यह तकनीक शोधकर्ताओं को डाउनस्ट्रीम उपयोगिता के लिए वेसिकल्स के निष्कर्षण और शुद्धिकरण के लिए उपकरण प्रदान करती है। पूरे या लाइसेड ऊतक ईवीएस के निष्कर्षण के बाद, प्रोटेओमिक, जीनोमिक और लिपिडोमिक विश्लेषण सहित वेसिकल्स का व्यापक लक्षण वर्णन किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, नमूनों का उपयोग अधिक लक्षित दृष्टिकोणों के लिए किया जा सकता है।
ऊतक नमूनों से सीधे अलग वेसिकल्स ट्यूमर उत्पत्ति सहित रोग तंत्र में और अधिक अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, और भविष्य में महत्वपूर्ण नैदानिक या शकुन उपकरण प्रदान कर सकते हैं ।
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
