Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Utvinning av extracellulära blåsor från hela vävnad
Chapters
Summary February 7th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här, tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att isolera små extracellulära blåsor (EVs) från hela vävnader, inklusive hjärnan och tumör exemplar. Denna metod erbjuder en reproducerbar teknik för att extrahera EVs från solid vävnad för ytterligare nedströms analyser.
Transcript
Detta protokoll ger en rigorös och reproducerbar teknik för extraktion och isolering av små extracellulära vesiklar från hela vävnad exemplar för nedströms ex-vivo analyser. Med bland de högsta nivåerna av renhet som för närvarande kan uppnås, underlättar denna metod direkt morphologic, immunophenotypic och djup karakterisering av interstitiell vesiklar utsöndras i olika vävnad exemplar, inklusive tumörer. Här visar vi isolering av vävnad EVs från hjärnan och lungtumör exemplar.
Emellertid, denna teknik kan tillämpas på studier med hjälp av olika, godartade, eller andra tumör exemplar samt. Till att börja, förbereda 10 milliliter av dissociation buffert i Hibernate-E medium för varje 0,4 till 1,0 gram vävnad. Tillsätt hela färsk eller fryst vävnad till bufferten i en 50 milliliter rör, och inkubera i ett varmt vattenbad vid 37 grader celsius i 20 minuter.
Efter detta, tillsätt proteas och fosfatashämmare för en slutlig 1x koncentration i dissociation bufferten. Häll lösningen med vävnaden i en lös passform downs homogenisator. Använd ungefär 30 långsamma slag per prov för att försiktigt dissociera vävnaden.
Sedan överför du den dissocierade vävnaden och buffertlösningen till ett 50 milliliter koniskt rör. Centrifugera vid 500x g och vid fyra grader celsius i fem minuter för att pelleta cellerna och de återstående fibrerna eller sammanhängande vävnad fragment. Överför supernatanten till ett rent koniskt rör på 50 milliliter, och centrifug vid 2, 000x g och vid fyra grader celsius i 10 minuter till pelleten och kassera det stora cellulära skräpet.
Överför denna supernatant till en ren 50 milliliter konisk rör, och centrifug vid 10, 000x g och vid fyra grader celsius i 40 minuter för att pelleta några oönskade större vesicles eller små apoptotiska kroppar. Dekantera supernatanten genom ett 0,45 mikrometerfilter till ett rent 12 milliliter ultracentrifugationsrör. Därefter ultracentrifug provet vid 100, 000x g och vid fyra grader celsius i två timmar, till pellet små EVs.
Dekantera supernatanten och låt ultracentrifugeringsrören inverteras i fem till tio minuter och knackar ofta för att avlägsna eventuell kvarvarande vätska på rörens sidor. Sedan, resuspend EV pelleten i 1,5 milliliter av 0,25 molar sackaros buffert. Täck rören med Parafilm, och sedan virvel eVs till lösning.
Rock ultracentrifugrören i 10 till 15 minuter i rumstemperatur. Och sedan virvel en gång till. Kortfattat centrifugera rören med en hastighet som är mindre än 1, 000x g för att återvinna vätskefjädringen i botten av röret.
Om det behövs, förvara fjädringen vid fyra grader varmt över natten. Lägg först till 1,5 milliliter 60 %iodixanol till 1,5 milliliter av sackarostriffertbufferten som innehåller elbilarna för att skapa en slutlig lösning som innehåller 30%iodixanol. Pipett upp och ner flera gånger för att blanda lösningen noggrant.
Överför denna lösning till botten av ett 5,5 milliliter ultracentrifugationsrör. Blanda därefter 60%iodixanol-lagret med ultrarent vatten för att förbereda minst 1,5 milliliter av både en 20%och en 10%iodixanollösning. Med hjälp av en spruta och en 18 gauge nål, mäta 1,3 milliliter av 20%iodixanol lösning och försiktigt lager den ovanpå bottengradienten.
Håll avfasning av nålen i kontakt med insidan av röret, strax ovanför menisken och tillsätt lösningen droppe klokt för att undvika att blanda lagren vid densitetsgränssnittet. Sedan, lager 1,2 milliliter av 10%iodixanol lösningen ovanpå 20%layer, med samma teknik. Noggrant balansera och belasta ultracentrifugeringsrören i rotorskopor.
Ställ in accelerations- och decelerationshastigheterna för en svänghinksrotor till minimihastigheterna, och centrifug på 268, 000x g och vid fyra grader celsius i 50 minuter. Medan provet håller på att centrifugeras, etikett 10 1,5 milliliter mikrocentrifugrör för varje prov som kommer att motsvara fraktioner ett till 10 av densitetsgradienten. När centrifugeringen är klar tar du försiktigt bort rören från rotorskoporna och placerar dem i en stabil hållare.
Pipett 10 seriefraktioner på 490 mikroliter från överkanten av lutningen till motsvarande rör. Med hjälp av en refraktometer, mät brytningsindexen för fraktionerna. Sedan, överför varje fraktion till en ren 12 milliliter ultracentrifugation röret.
Tillsätt fem milliliter 1x PBS till varje rör och pipetten upp och ner långsamt för att blanda. Tillsätt ytterligare sex milliliter på 1x PBS till toppen av röret, och blanda försiktigt igen. Ultracentrifug rören på 100, 000x g och vid fyra grader celsius för att åter pellets de små vesiklar.
Dekantera supernatanten och knacka rören torra innan du lyser vesiklarna för proteinanalys eller reresuspending eVs för morphologic analys. För att lysa EVs för proteinanalys, tillsätt 40 mikroliter av stark lysbuffert som innehåller proteashämmare till EV-pelletsen. Placera Parafilm över varje rör, och virvel kraftigt.
Därefter rockar du rören i 20 minuter i rumstemperatur och virvel igen. Kortfattat centrifugera provet vid 1, 000x g i 30 till 60 sekunder för att återvinna hela provvolymen. Överför varje prov till ett nytt 1,5 milliliter mikrocentrifugrör, och förvara det vid en temperatur mellan 20 och 80 grader celsius tills det är klart för vidare bearbetning.
För att förbereda de renade lysaterna för immunoblotanalys, tillsätt 5x Laemmli provbuffert till proverna för en slutkoncentration på 1x. Koka provet vid 95 grader varmt i fem till 10 minuter. Sedan, ladda en lika volym av fraktioner en till 10 i en 10%SDS sida gel.
Ladda en lika stor massa av vävnads homogenat. Utför elektrofores och Western blot analys för att bekräfta EV proteiner i de renade lysates och jämföra relativa EV överflöd i fraktioner. I denna studie extraheras extracellulära vesiklar och renas från hela vävnaden.
Efter ultracentrifugeringen av 10 till 30%iodixanolgradienten kan en population av lätta elbilar ses migrera upp till bråkdel två, medan en population av täta elbilar kan ses migrera upp till bråkdel fem, beroende på vävnadstyp. Representativa immunoblots av gradient fraktioner uppvisar effektiv separation och rening av små tumör härledda EVs i bråkdel fem. Noterbart, lungtumör exemplar visas berikas i tät EVs jämfört med lätta EVs som tidigare skördats från hela hjärnvävnaden.
Representativ nano partikel spårning analys och elektronmikroskopi av vävnad-härledda vesiklar i den dominerande vesikel som innehåller fraktion visar anrikning och bevarande av hela vesiklar. Överensstämmer med den kända storleken och strukturen hos små EVs. Interstitiell EVs representerar lovande mål för utveckling av nya diagnostiska eller prognostiska biomarkör analyser.
Denna teknik ger forskare med verktyg för utvinning och rening av vesicles för nedströms nytta. Efter extraktion av hel eller lyst vävnad EVs, bred karakterisering av vesikel inklusive proteomic, genomisk och lipidomic analyser kan utföras. Dessutom kan prover användas för mer riktade metoder.
Vesiklar isolerade direkt från vävnad exemplar kan ge ytterligare insikt i sjukdomar mekanismer, inklusive tumör genesis, och kan ge viktiga diagnostiska eller prognostiska verktyg i framtiden.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
