CRISPR/Cas9 gebruiken om GM-CSF uit te nemen in CAR-T-cellen

Ons protocol beschrijft de genetische modificatie van DE CEL VAN CAR-T tijdens hun productie via de CRISPR-technologie om effectiever en minder giftig product te genereren. Een voordeel van deze techniek is dat car-t celproductie en genetische manipulatie beide kunnen voorkomen in één cel met een goede efficiëntie. Het aantonen van de procedure zal Worden Rosalie Sterner, een MD promovendus, Michelle Cox, een technoloog en een afgestudeerde student, en Reona Sakemura, een postdoctoraat collega, uit mijn laboratorium.

Na het isoleren van T-cellen uit geoogste perifere bloed mononucleaire cellen, beginnen met het kweken van hen door eerst de voorbereiding van T-cel medium en vervolgens steriliseren door het te filteren door middel van een 0,45 micrometer steriele vacuüm filter en vervolgens met een 0,22 micrometer steriele vacuüm filter. Op de dag van T-cel stimulatie of dag nul, voorafgaand aan stimulatie, wassen CD3/CD28 kralen door het plaatsen van de vereiste hoeveelheid kralen in een steriele 1,5 milliliter microcentrifuge buis en resuspending in een milliliter van TCM. Plaats de buis gedurende één minuut in contact met een magneet.

Dan aspirate de TCM en resuspend in een milliliter verse TCM om de kralen opnieuw te wassen en te herhalen voor een totaal van drie wasbeurten. En tenslotte, resuspend de kralen in een milliliter van TCM. Na het tellen van de T-cellen, breng de kralen naar de T-cellen met een verhouding van drie tot een kralen naar cellen.

Verdun vervolgens de cellen tot een uiteindelijke concentratie van een miljoen cellen per milliliter en incubeer bij 37 graden Celsius, 5% CO2 gedurende 24 uur. Na het verwerven van een CART19 constructie in een lentivirale vector, uitvoeren lentivirale productie door de eerste uitbroeding lentiviral plasmide, verpakking vector, envelop vector, precomplexing reagens, transfectie reagens, en transfectie medium bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voer lentivirale werkzaamheden uit met behulp van BSL2+-voorzorgsmaatregelen, waaronder celkweekkappen, persoonlijke beschermingsmiddelen en desinfectie van gebruikte materialen met bleekmiddel voordat ze worden verwijderd.

Voeg na incubatie deze transfectiereagentia toe aan de 293 T-cellen die 70 tot 90% samenvloeiing hebben bereikt en de getransfecteerde cellen kweken bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Op 24 en 48 uur na de doorfectie, oogst, centrifuge, filter en concentraat virus-bevattende supernatant door ultracentrifugatie en bevriezen bij min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik. Op dag één, voorzichtig resuspend T-cellen die zijn gestimuleerd op een miljoen cellen per milliliter op dag nul om de rozetten van cellen te breken.

Voeg volgens de juiste BSL2+-voorzorgsmaatregelen vers of bevroren geoogst virus toe aan de gesimuleerde T-cellen bij een veelheid aan infectie van 3,0. Blijf de getransduceerde T-cellen uitbroeden bij 37 graden Celsius, 5%CO2. Op dag drie en vijf tellen ze CAR-T-cellen en voeg verse voorverwarmde TCM toe aan de cultuur om een CAR-T-celconcentratie van een miljoen cellen per milliliter te behouden.

Zes dagen na de simulatie, verwijder kralen uit de getransduceerde T-cellen door eerst oogsten en resuspending de cellen. Breng de cellen in 50 milliliter conische buizen en plaats de buizen in een magneet voor een minuut. Na het verzamelen van de CAR-T cel-bevattende supernatant en het weggooien van de kralen, plaats de cellen terug in de cultuur op een concentratie van een miljoen cellen per milliliter in een cultuurkolf.

Gebruik een monster van cellen voor stroomcytometrie om de oppervlakteexpressie van de CARs te beoordelen. De rest uitbroeden om de expansie te hervatten en vervolgens de cellen te oogsten en cryo-te bewaren op dag acht, zoals beschreven in het manuscript. Om de granulocyte macrofaag kolonie stimulerende factor verstoren, gebruik maken van een gids RNA zoals beschreven in het manuscript.

Incubeertransfectiereagentia bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voeg ze na incubatie toe aan de 293 T-cellen die 70 tot 90% samenvloeiing hebben bereikt en kweek de getransfecteerde cellen bij 37 graden Celsius, 5% CO2 om een lentivirus te produceren. Op 24 en 48 uur, oogst en concentraat virus-bevattende supernatant door ultracentrifugatie in 50 milliliter ultracentrifuge buizen en bevriezen bij min 80 graden Celsius voor toekomstig gebruik.

Dan op dag een, voorzichtig resuspend de T-cellen te breken rozetten rozetten. In een BSL2+-goedgekeurd laboratorium, om CAR-T-cellen te genereren, voegt u CAR19 lentivirus en GMCSF-gericht CRISPR lentivirus toe aan de gesimuleerde T-cellen. Op dag drie en dag vijf voor met succes getransduceerde lentiCRISPR-bewerkte T-cellen met puromycine resistentie, behandelen cellen met puromycine dihydrochloride bij een concentratie van een microgram puromycine per milliliter.

Tide sequencing werd gebruikt om een GM-CSF vermindering van GM-CSF knock-out CART19 cellen te bevestigen met een verstoring efficiëntie van ongeveer 71%Flow percelen van CAR-T cel oppervlak vlekken gated op live CD3-positieve cellen blijkt dat zowel wild-type CART19 en GM-CSF knock-out CART19 met succes en op een soortgelijke manier express de CAR oppervlak receptor in vitro. Aan de andere kant, intracellulaire kleuring van GM-CSF door flow cytometrie ook gated op live CD3-positieve cellen toont een verminderde expressie van GM-CSF in de knock-out cellen in vergelijking met wild-type CART19 cellen bevestigen functioneel succes van de knock-out. Bijzondere aandacht moet worden besteed aan de transductiestappen van deze procedure, aangezien zij het meest van cruciaal belang zijn voor de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde CAR-T-cellen.

De beschreven methode kan mogelijk worden toegepast op een verscheidenheid aan genen om CAR-T-cellen te wijzigen via CRISPR/CAS9 om te helpen bij het genereren van een minder giftig en effectiever product. CRISPR/CAS9-technologie biedt de strategieën om het genoom van CAR-T-cellen rechtstreeks te richten op het ontwikkelen van oplossingen voor de huidige klinische tekortkomingen.