Biology
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Summary May 14th, 2019
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这种方法依赖于在成年斑马鱼的胸部注射0.5-3Μl 溶液。该程序有效地将蛋白质和化合物输送到斑马鱼心脏附近, 而不会损害器官。该方法适用于检测外源因素对心脏各组织的影响。
Transcript
在成人斑马鱼的心脏研究中，药物治疗通常是以系统的方式完成的。通过胸内注射，可以局部地为心脏提供溶液，而不会造成心肌损伤。这种方法允许在成年斑马鱼的心脏周围提供少量药物、蛋白质或其他分子。
要开始此过程，请使用拔针器拉取微注射适应的硅酸盐玻璃毛细管。将拉扯的毛细管存放在九厘米的培养皿中，并配有建模粘土或胶带的导轨。用普通的剪刀，剪一块海绵，在中间刻一个鱼一样的剪影。
接下来，用测试的蛋白质或其他化合物准备注射溶液的小等分。根据测定结果调整其浓度，稀释1倍汉克斯平衡盐溶液中的物质，并辅以10%酚红色。为了获得麻醉剂的工作浓度，在含有100毫升鱼水的烧杯中加入2至3毫升的三分鱼份溶液。
首先，用顶部的光线打开立体显微镜，将放大倍数调整为 16 倍。用鱼水浸泡海绵，放在显微镜上的九厘米培养皿上。调整对焦，在立体显微镜下，使用虹细胞切除术剪刀从底座上切割约7毫米的微胶囊的端端，详见文本协议的图1A。
将切割的微胶囊插入微注射器装置的针架中。使用微加载器尖端，加载控制溶液以设置喷射压力，以获得适当的流量，然后清空针头。在此之后，将喷射溶液的选定体积加载到毛细管的尖端，确保没有气泡。
使用网捕捉成年鱼，并转移到麻醉溶液。一到两分钟后，当鱼停止游泳，操作量的运动减少时，用塑料勺子触摸鱼，以确保它不会对任何接触做出反应。接下来，快速小心地将鱼转移到湿海绵的凹槽中，腹侧向上。
鱼头应指向远离操作员的主要手。在立体显微镜下，仔细观察跳动的心脏在鱼皮下的运动。目视地确定跳动的心脏上方的注射点和三角形的中间，由心室推车板定义。
将毛细管的尖端以相对于车身轴的 30 至 45 度的角度插入。用微胶囊的尖端轻轻穿透皮肤。一旦针头进入胸腔内，按下微注射器装置的踏板以完成注射。
注射后，轻轻地从胸毛中取走毛细管，并立即将鱼转移到带系统水的水箱中进行回收。监测鱼，直到完全从麻醉中恢复。要分析注射的效果，请收集所需时间点的心脏，并准备进一步分析。
在这项研究中，外源化合物和蛋白质被传递到心内腔，以研究它们对成年斑马鱼心脏的影响。为了验证这种方法，通过向安乐死鱼中注入颜色和荧光染料，进行了两项测试实验。在这两种分析中，全安装分析揭示了整个心脏的标签，包括心室、中庭和球茎动脉。
这些结果表明注射溶液在心脏表面的高效传播。为了比较胸内注射与心内注射的适宜性，使用这两种方法注射了同样数量的DAPI。心脏在五分钟或120分钟后被固定。
在任一时间点注射后，在心脏中未观察到DAPI阳性细胞。相比之下，胸内注射导致在心肌中存在DAPI标记的核。这些结果表明，与腹内注射相比，胸内注射改善了化合物到心脏的输送。
为了测试这种方法是否适合心脏再生研究，心室是冷冻受伤的，然后在冷冻伤害后三天和七天进行注射。肌膜和损伤组织都含有大量DAPI阳性细胞，表明这种染料有效地渗透到完整的心脏和纤维组织中。此外，注射的 phaloidin AF649 也由受伤区的心肌细胞和受伤区域的一些招募的成纤维细胞合并。
这个实验表明，药物可以穿过史诗，渗透到底层的心肌。在用染料测试胸内注射效率后，分析注射蛋白质对心脏的影响。为此，对外源细胞因子对各种过程的影响进行了调查。
心肌细胞增殖、细胞外基质沉积、免疫细胞招募和心脏保护基因表达的生物学方面通过细胞因子的细胞内注射激活。这些结果表明，在细胞内注射提供了一个合适的策略，有针对性地输送蛋白质，以研究它们在各种测定中对不同心脏组织的影响。将针头插入到中，是成功注射的关键步骤。
针头的形状、穿透角度和穿刺点都是影响针头插入的因素。在注射后或之前，可以进行低温伤害，以分析注射分子对心脏再生的影响。斑马鱼中用于研究心脏预置的胸内注射。
一种叫做CNTF的蛋白质被注射，并已被证明可以增强心脏的细胞保护和亲再生程序。
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