Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
ضبط التدهور لتحقيق استنفاد البروتين محددة وفعالة
Summary July 20th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
هنا، نقدم بروتوكول لاستنفاد بشكل فعال وعلى وجه التحديد بروتين من الفائدة في الخميرة Saccharomyces سيريفيسياي باستخدام نظام بيتا-است AID.
Transcript
وهناك تقنية شائعة لمعرفة وظيفة البروتين هو حذفه ومعرفة ما سيحدث. ولكن لا يمكنك أن تفعل ذلك مع البروتين الأساسي. من الضروري أن تموت الزنزانة
لذلك كنت في حاجة الى وسيلة لإزالة هذا البروتين وقبض على لمحة عما يحدث قبل موت الخلايا. وينبغي أن يكون استنفاد البروتين سريع، حتى تحصل على أي آثار ثانوية. وينبغي أن تكون محددة، بحيث يتم إزالة البروتين فقط ونضوب فقط عندما تريد أن تكون.
وينبغي أن لا تؤثر على الخلية بأي طريقة أخرى من إزالة هذا البروتين. بعد إعداد السلالة، استخدم ثقافة بين عشية وضحاها لتحديد ما هو التخفيف المطلوب. استخدم هذه المعلومات لإعداد ثقافة جديدة كافية مع OD600 بين 0.1 و 0.2، وتنمو عند 30 درجة مئوية.
في غطاء الدخان، أضف ميثانول يعادل 30 إلى 50٪ من حجم العينة المقصود إلى أنبوب 15 ملليلتر. أغلق الأنابيب بإحكام، وضع علامة عليها، ووضعها على الجليد الجاف للبرد. المقبل، تسمية أنابيب 1.5 ملليلتر لتخزين طويلة الأجل من العينات ووضع على الجليد لتبرد.
يبرد على الأقل ملليلتر من الماء لكل عينة على الجليد. وبمجرد بلوغ الكثافة البصرية المستهدفة لبدء فترة الحضانة، يتم نقل عينة إلى أنبوب معد مسبقاً يحتوي على الميثانول البارد. عكس أنبوب لفترة وجيزة ووضعها مرة أخرى على الجليد الجاف.
هذه هي عينة التحكم غير المستحثة. على الفور، إضافة بيتا استراديول بحيث التركيز النهائي هو 10-ميكرومولار. دوامة بقوة لخلط.
الاستمرار في تنمية الثقافة كما كان من قبل، احتضان مع بيتا استراديول للوقت الأمثل كما هو موضح في بروتوكول النص. وقت حضانة بيتا استراديول هو الخطوة الأكثر أهمية، ويجب أن يكون الأمثل لكل بروتين. قصيرة جدا والنضوب غير مكتمل وبطيئة.
فترة طويلة جدا ومستويات البروتين سوف تنخفض حتى قبل أن كنت قد أضاف أوشين. Pipette حتى 0.5 ميكرولتر من IAA لكل ملليلتر من الثقافة لإضافة في وقت لاحق. تجميع عينة من الثقافة غير pleed كما هو موضح سابقا.
على الفور إضافة IAA إلى تركيز النهائي من 750 ميكرومولار ودوامة بقوة لخلط. بدء مؤقت في أقرب وقت ممكن بعد خلط. جمع العينات وفقا للتصميم التجريبي.
ثم ضع العينات على الجليد. تأكد من أن أيا من العينات قد جمدت. إذا كان لديك أي، والدفء بلطف لهم في اليد في حين عكس باستمرار.
وبمجرد جمع جميع العينات وعدم تجميدها، يتم تجميعها بالطرد المركزي عند 3,500 مرة من G و4 درجات مئوية لمدة دقيقتين. صب قبالة الميثانول والمتوسطة مزيج ووضع العينات مرة أخرى على الجليد. ثم، resuspend بيليه الخلية في ملليلتر واحد من الماء ونقل هذا التعليق إلى أنبوب المسمى على الجليد.
أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في سرعة أكثر من 15،000 مرات G لطارد الخلايا. بعد هذا، ضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد وpirpirate السائل. في هذه الدراسة، يتم ضبطها التحلل لتحقيق استنفاد البروتين محددة وفعالة دون أن تؤثر على التمثيل الغذائي للخلية الخميرة.
يتم استنفاد بروتينات Prp2 وPrp22 ذات الوفرة المنخفضة إلى أقل من 20٪ بعد 20 دقيقة من الحضانة المسبقة مع بيتا استراديول، تليها 15 دقيقة مع الأوشين. أطول قبل الحضانة مرات تؤدي إلى استنزاف أسرع، ولكن أيضا تظهر استنفاد البروتين غير المرغوب فيه قبل إضافة أوكسين. بالمقارنة، و Dcp1 أكثر وفرة فقط استنفدت إلى ما يقرب من 30٪ مع نفس المعاملة.
ومع ذلك، 60 دقيقة من وقت ما قبل الحضانة يؤدي إلى استنفاد إلى 13٪ مع نفس العلاج أوسين على حساب نضوب قبل إضافة أوسين. تحسين وقت ما قبل الحضانة، ولا تفقد المسار من الوقت بين النقاط الزمنية الخاصة بك. ما يجب القيام به بعد ذلك يعتمد على سؤالك.
لقد وجدنا أن عينة 10 ميل من الثقافة كافية لتحليل البروتين أو الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. كما أن إجراء أخذ العينات قابل للتكيف بسهولة بالنسبة لـ ChIP. الآن هناك طريقة سريعة ومحددة لنضوب البروتينات.
لذلك يمكن العثور على وظيفة حتى من البروتينات الأساسية. البروتوكول آمن إلى حد ما. الميثانول هو المادة الكيميائية الخطرة الوحيدة.
العناية في حين الاستغناء عنه. تفعل ذلك في غطاء محرك الدخان، وارتداء اثنين من أزواج من القفازات، كما يمكن الحصول على الميثانول من خلال معظم قفازات نيتريل.
Related Videos
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
