Biochemistry
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自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング
Chapters
Summary October 23rd, 2019
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キナーゼ阻害剤のスクリーニングのための自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイの生成のための詳細なプロトコルが提示される。
Transcript
NAPPAは、タンパク質活性と機能の研究に公平な高スループット方式で使用できる強力なタンパク質マイクロアレイプラットフォームです。NAPPA上に表示されるタンパク質は、天然の折り畳みおよび活性の可能性を向上させるために、ヒト由来リボソームおよびシャペロンを用いたヒトベースの発現系で生成されます。キナーゼ阻害剤のスクリーニングのためのNAPPAアレイの使用は、新薬および臨床的に関連するキナーゼ突然変異のテストのための新しいプラットフォームを提供する。
NAPPAの方法論によって生成されるタンパク質マイクロアレイは、バイオマーカー発見、タンパク質とタンパク質相互作用、基質同定、薬物スクリーニングなど、多くの異なる用途に使用できます。途中で品質管理の手順を実行します。DNA調製、DNAマイクロアレイ、タンパク質マイクロアレイの品質をテストします。
何らかのステップで品質が良くない場合は、最初からやり直してください。手順を実証することは、私の研究室の技術者リサ・ミラーです。家の高い効率のミニ準備のための細菌の成長を準備するために、最初に96ウェル形式でオーガープレートの細菌を接種し、16時間成長させます。
翌日、抗体アンピシリンを添加した1.5ミリリットルの素晴らしいスープ培地で深井戸プレートの各井戸を充填します。抗体はプラスミド上の選択マーカーに依存する。その後、80%エタノールと炎で96ピン装置を殺菌する。
滅菌96ピン装置を使用して、一晩のインキュベートされた寒天プレートからコロニーを選び、深い井戸プレートの井戸に沈んで培養を接種する。ブロックにガス透過性シールを覆い、シェーカーで37°C、300〜800rpmで22〜24時間インキュベートします。その後、ペレット培養し、原稿に従って培養を再中断する。
溶解する細菌は、各ウェルに200マイクロリットルの溶液を加え、プレートをアルミニウムシールで密封し、5回反転します。細胞を正確に5分間インキュベートします。溶液を中和するには、溶液3の200マイクロリットルを加え、アルミニウムシールでプレートを密封し、5回反転します。
次いで、プレートを3800G、摂氏4度で回転させ、30分間回転させて、上澄み糖をクリアします。アニオン交換樹脂プレートを調製するには、まず、アニオン交換スラリーを混合し、スラリーをガラストラフに注ぎます。深い井戸の版の上に積み重ねろめろ、廃棄物回収容器として機能する。
次に、ワイドボードP1000チップを使用して、スラリーを混合し、450マイクロリットルのスラリーをフィルタープレートの各ウェルに移します。遠心分離機とフロースルーを破棄します。さて、樹脂板と深い井戸ブロックのスタックに溶草上清を移します。
積み重ねられたプレートを30倍Gで5分間回転させ、速度を遅くしてフロースルーを破棄します。カラムを洗浄するには、400マイクロリットルの溶液N3洗浄バッファーを各ウェルに加えます。洗浄バッファーを除去するために、樹脂板を真空マニホールドに移します。
洗浄工程を3回繰り返し、残りのワッシャーバッファーを30回の短い5分間回転で取り除き、DNAを溶出G.To、樹脂板をきれいな800マイクロリットルの回収プレートに置きます。各ウェルに300マイクロリットルの溶液N5を加え、室温で10分間座らせます。その後、積み重ねられたプレートを20倍Gで5分間回転させ、ゆっくりとランプアップ速度を233倍Gに1分間回転させます。
使用前にマイナス20°Cでプレートを保管してください。まず、スライドをラックに置き、2%アミノシラン試薬を含むガラスリザーバにスライドをアセトンに沈めます。スライドを15分間揺らす。
その後、スライドをアセトンですすい、その後に水で最後のすすがりします。次に、圧力をかけた空気を使用してスライドを乾燥させます。すべての水滴が除去されるまで、約3分間、すべての角度からそれらを吹き飛ばす。
コーティングされたスライドを密閉された箱の中の金属製のラックに室温で保管します。さて、原稿に記載されているようにDNAを沈殿させる。その後、20マイクロリットルの超純水でDNAペレットを再懸濁し、1000rpmで2時間振る。
アレイサンプルを調製するには、各DNAサンプルに抗体、架橋剤、ポリリシンを含む、10マイクロリットルの新しいプリンティングミックスを加えます。アルミニウム箔でプレートをシールし、室温で90分間1000rpmで振ります。プレートを摂氏4度で一晩保管してください。
印刷日には、簡単に渦を回転させ、プレートを回転させます。各サンプルの28マイクロリットルを384ウェルプレートに移します。アミノシランコーティングスライドと384ウェルプレートをアレイアデッキに配置し、マイクロアレイ印刷プログラムを開始します。
印刷が完了したら、マイクロアレイにラベルを付けます。マイクロアレイは、さらに使用されるまで数ヶ月間保存することができます。DNAのレベルを測定するには、スライドをピペットボックスに入れ、50ミリリットルのブロッキングバッファーでそれらをブロックします。
室温でロッキングシェーカーのスライドを1時間インキュベートします。次いで、溶液を廃棄し、20ミリリットルのブロッキングバッファーと33マイクロリットルの蛍光DNAインターカレーティング色素を添加する。攪拌で15分間インキュベートします。
インキュベーションが終わったら、スライドを超純水で素早くすすい、圧力をかけた空気で乾かします。マイクロアレイをスキャンする準備が整いました。マイクロアレイを表現するには、先に示したようにスライドをブロックし、超純水ですすいで、ろ過された圧縮空気で乾燥させます。
各スライドにシーリングガスケットを取り付けます。130ミリリットルのインビトロ転写と翻訳ミックスをスライドに加え、インビトロ転写と翻訳ミックスが広がり、気泡なしでアレイの全領域を覆うように、シールガスケットを穏やかにマッサージします。両方のポートに小さな丸いポート シールを適用します。
タンパク質発現のために摂氏30度で90分間インキュベートし、続いて摂氏15度で30分ずつインキュベートし、クエリタンパク質を固定化します。その後、ガスケットを取り出し、スライドをそれぞれ15ミリリットルTBSTで5分間3回洗浄し、同じ溶液中で1時間ブロックします。アレイ上のタンパク質の検出のために、ミルクでTBSTを取り除き、グリッドプレートにスライドを置き、一次抗体の600マイクロリットル、マウス抗旗、希釈1〜200、および5%ミルクを加えた1x TBSTを適用します。
室温で1時間インキュベートする。スライドを1x TBSTの50ミリリットルで洗浄し、揺れるシェーカーで5%ミルクを3回5分間洗います。二次抗体に対して手順を繰り返します。
1時間のインキュベーションが終わったら、揺れるシェーカーの1x TBSTでスライドを3回5分間洗います。その後、スライドを超純水で素早くすすぐすまい、加圧空気を用いて乾燥させます。スライドをスキャンする準備ができました。
ホスファターゼ及びDNase処理を行うために、原稿に記載されているように3%BSAを補足したTBSTで発現したスライドを洗浄し、ブロックする。次に、スライドをグリッドプレートに置き、200マイクロリットルのホスファターゼDNase溶液を塗布します。蒸発を避けるために、マイクロアレイカバースリップを上に置きます。
オーブンで1時間30分間摂氏30度でインキュベートします。その後、揺れるシェーカーに1x TBSTと0.2モルの塩化ナトリウムをそれぞれ5分間3回洗浄します。薬物処理とキナーゼ反応を行うには、スライドをグリッドプレートに置き、200マイクロリットルの薬物キナーゼ溶液を塗布する。
蒸発を避けるためにカバースリップを上に置きます。オーブンで摂氏30度で1時間インキュベートします。再現可能なデータの鍵は、スライド間で一貫したインキュベーション時間です。
これはキナーゼ反応の間に特に重要である。各スライドの処理に必要な時間を考慮する必要があります。その後、揺れるシェーカーに1x TBSTと0.2モルの塩化ナトリウムをそれぞれ5分間3回洗浄します。
TBSTで1~100に希釈した一次抗体ホスホチロシン抗体として使用したタンパク質検出を繰り返し、3%ウシ血清アルブミンを補った。1x TBSTおよび3%ウシ血清アルブミンを一次抗体でのインキュベーション後の洗浄に使用し、二次抗体によるインキュベーション後の洗浄にはTBSTを使用する。以前のように洗って乾燥させます。
画像取得の場合は、マイクロアレイをスライドホルダーマガジンにロードします。マガジンをマイクロアレイスキャナーにロードします。最適化された設定ですべてのマイクロアレイをスキャンし、実験全体で画像を比較するときに自動ゲインをオフにすることを忘れないでください。
画像を定量化ソフトウェアに転送し、グリッドをスポットに合わせ、マイクロアレイ上の各機能の信号強度を定量化します。統計分析を進めます。本研究では、マイクロアレイは、相補的なDNAを含むスポットの大部分が、タンパク質の検出可能なレベルを正常に表示したことを示した。
NAPPAキナーゼマイクロアレイは、スライド間で良好な再現性を示し、異なる印刷バッチ間のタンパク質表示レベルの相関は0.88を超えた。NAPPAキナーゼアレイにおけるキナーゼ活性の代表的な結果は、発現後に高レベルのタンパク質リン酸化を示した。ホスファターゼ処理直後にリン酸化レベルを測定したマイクロアレイと、60分間の自己リン酸化反応の後、アレイ上に活性タンパク質キナーゼが存在することが示唆された。
NAPPAキナーゼアレイでは、イマチニブはABL1およびBCR-ABL1活性の有意な減少を示したが、他のキナーゼはほとんど影響を受けなかった。脱リン酸化アレイに対して正規化し、陽性制御マイクロアレイの割合として表されるキナーゼ活性は、ABL1およびBCR-ABL1に対するイマチニブの選択的阻害を示した。イブルチニブスクリーニングで得られた典型的な結果は、ABL1非関連キナーゼのキナーゼ活性が影響を受けずであることを示した。
BTKの正規標的、およびERBB4潜在的新標的は、イブルチニブの存在下で活性の低下を示した。データは、ERBB4が用量特異的な方法でイブルチニブによって阻害することができることを示唆している。タンパク質マイクロアレイスクリーニングの成功は、マイクロアレイ自体の品質に大きく依存しています。
適切なデータ分析を可能にするために、いくつかの正および負の制御機能を使用する必要があります。NAPPAキナーゼアッセイはスクリーニングプラットフォームであり、そのため、得られたデータは、インビトロキナーゼアッセイ、または細胞ベースのアッセイを含む可能性のあるフォローアップアッセイで検証されるべきである。プロトコルはcDNAから始まるので、任意のキナーゼの変異や変動をマイクロアレイに簡単に組み込み、高スループットで研究することができます。
アニオン交換樹脂スラリーやプレートの調製時には、樹脂粒子の吸入を防止するためにマスクを使用することが推奨される。
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