क्रोनिक साल्मोनेला संक्रमण प्रेरित आंत्र फाइब्रोसिस

ऊतक फाइब्रोसिस प्राथमिक तरीका है कि अंग समय के साथ विफल हो जाते हैं, पुरानी सूजन या उम्र बढ़ने के जवाब में। और वास्तव में, मैं तर्क है कि अगर आप एक संक्रामक एजेंट या कैंसर से मर नहीं है, तो आप की संभावना अंग फाइब्रोसिस से मर जाएगा के रूप में आप उंर । दुर्भाग्य से, मानव ऊतक फाइब्रोसिस की नकल करने के लिए बहुत सारे महान माउस मॉडल नहीं हैं।

तो हमने जो विकसित किया है वह क्रोन की बीमारी का एक माउस मॉडल है, जो मानव में एक बीमारी है जो आंत के फाइब्रोसिस का कारण बनती है और काफी हद तक अनुपचारित है। वास्तव में, एक ही रास्ता आप इसका इलाज कर सकते हैं फाइब्रोटिक ऊतक और आंत के फिर से बंधन के सर्जिकल हटाने के माध्यम से है। हमारे मॉडल का लाभ यह है कि यह सभी माउस उपभेदों में पूरी तरह से प्रवेशात्मक है और यह बहुत बारीकी से मानव क्रोन की बीमारी की नकल करता है और फाइब्रोसिस एक महीने से अधिक समय तक बना रहता है, जो वास्तव में एक मजबूत मॉडल है।

इस प्रक्रिया का सबसे चुनौतीपूर्ण हिस्सा चूहों और विशेष रूप से मौखिक गैवरेज की हैंडलिंग है क्योंकि इसके लिए बहुत सारे अभ्यास विशेष प्रमाणन की आवश्यकता होती है। पहली बार इस प्रक्रिया को करते समय, किसी को पता होना चाहिए कि साल्मोनेला के साथ काम करने के लिए उचित सुरक्षा सावधानियों और बाँझ तकनीक की आवश्यकता होती है। प्रयोग से पहले कचरे और बैक्टीरिया के निपटान की योजना बनाई जानी चाहिए ।

इस प्रक्रिया का दृश्य प्रदर्शन बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि इसमें साल्मोनेला की हैंडलिंग शामिल है जिसके लिए विशेष सुरक्षा सावधानियों के साथ-साथ उचित बाँझ तकनीक की आवश्यकता होती है। इस प्रक्रिया को शुरू करने के लिए, 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त पौंड एगर के साथ एक प्लेट निर्धारित करें। एक बाँझ inoculating पाश का उपयोग करना, एस typhimurium डेल्टा तीर एक के एक जमे हुए ग्लिसरोल स्टॉक के साथ थाली लकीर ।

रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। लकीर प्लेटों को एक सप्ताह तक चार डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। संक्रमण से एक दिन पहले, एंटीबायोटिक तैयार करने के लिए 2.5 मिलीलीटर पानी में 0.5 ग्राम स्ट्रेप्टोमाइसिन को भंग करें।

फ़िल्टर स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान को स्टरलाइज करें। फिर, एक मिलीलीटर सिरिंज के साथ एक बल्ब-इत्तला दी गई 22 गेज गैवेज सुई का उपयोग करें ताकि स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान के 100 माइक्रोलीटर के साथ चूहों को मौखिक रूप से गैवर किया जा सके। इसके बाद, एक संस्कृति ट्यूब के लिए 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एकाग्रता पर स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त एलबी शोरबा के तीन मिलीलीटर जोड़ें।

एक टीका पाश का उपयोग करना, एक ही कॉलोनी के साथ पौंड शोरबा टीका। २०० आरपीएम पर मिलाते हुए ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति को aerobically रात भर इनक्यूबेट । संक्रमण के दिन, अंतिम संक्रमण खुराक तैयार करने के लिए बाँझ पीबीएस के साथ रात भर साल्मोनेला संस्कृतियों के लगातार दो से 10 कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करें।

इसके परिणामस्वरूप लगभग तीन मिलियन कॉलोनी बनाने वाली 100 माइक्रोलीटर इनोकुलम होती है। इसके बाद, तैयार साल्मोनेला के 100 माइक्रोलीटर के साथ प्रत्येक माउस को गैवेज करने के लिए एक मिलीलीटर सिरिंज के साथ बल्ब-इत्तला दी गई 22 गेज गैवेज सुई का उपयोग करें। सबसे पहले, दो मिलीलीटर सुरक्षित-लॉक राउंड बॉटम माइक्रोट्यूब सेट करें, बाँझ पीबीएस के एक मिलीलीटर और प्रत्येक ट्यूब में एक ऑटोक्लेव्ड स्टेनलेस स्टील मनका जोड़ें।

ऊतक संग्रह से पहले ट्यूबों का पूर्व-वजन करें। चूहों को इच्छामृत्यु के बाद, उनके सीकल और प्लीहा ऊतकों को फिर से काटें, जिससे अलग-अलग जानवरों से ऊतक को अलग-अलग ट्यूबों में इकट्ठा करना सुनिश्चित होता है। ऊतक वजन निर्धारित करने के लिए प्रत्येक ट्यूब का वजन करें।

15 मिनट के लिए 30 हर्ट्ज पर ऊतकों को समरूप बनाने के लिए मिक्सर मिल उपकरण का उपयोग करें। फिर, पीबीएस के 900 माइक्रोलीटर को 96-अच्छी तरह से दो मिलीलीटर मेगा ब्लॉक के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें। पिपेट 100 माइक्रोलीटर ऊतक समरूप पहले कुएं में जाते हैं, और अच्छी तरह से मिलाते हैं।

बाद के कुओं में 100 माइक्रोलीटर जोड़कर सीरियल कमजोर पड़ने का काम करें, जब तक कि नकारात्मक छठे कमजोर पड़ने के लिए 10 प्राप्त न हो जाए। एलबी एगर पर ट्रिप्लिकेट में प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 माइक्रोलीटर प्लेट जिसमें स्ट्रेप्टोमाइसिन होता है। फिर, औसत कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों की गणना करें और टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रति ग्राम ऊतक में कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों का निर्धारण करें।

ओपन फिजी, जो एक खुला सोर्स इमेजिंग सॉफ्टवेयर है और टूल बार पर टिफ इमेज फाइल को खींचें और छोड़ दें। मेनू बार पर, छवि को लाल, हरे और नीले चैनलों में विभाजित करने के लिए छवि, प्रकार, आरजीबी स्टैक चुनें। चैनल को हरे रंग में सेट करने के लिए पैनल के नीचे क्षैतिज बार स्लाइड करें।

ओपन इमेज, एडजस्ट, थ्रेसहोल्ड टूल। किसी भी पृष्ठभूमि संकेतों को खत्म करने के लिए न्यूनतम और अधिकतम सीमाएं समायोजित करें। एक बार वांछित सीमा सेट हो जाने के बाद, सीमा टूल को बंद करें और विश्लेषण करने, माप सेट करने, क्षेत्र की जांच करें, क्षेत्र अंश, सीमा और डिस्प्ले लेबल तक सीमित करें।

फ्रीहैंड चयन या बहुभुज चयन उपकरण के साथ ऊतक चयन प्राप्त करें और विश्लेषण, उपाय पर क्लिक करके कोलेजन के लिए सकारात्मक प्रतिशत क्षेत्र को मापें। फिर, ऊतक क्षेत्र में कोलेजन धुंधला करने के लिए पूर्ण क्षेत्र सकारात्मक सामान्य करें। स्ट्रेप्टोमाइसिन उपचार एस टाइफ्यूरियम डेल्टा तीर के साथ मौखिक संक्रमण के बाद एक मजबूत आंतों की सूजन और फाइब्रोसिस की ओर जाता है, विशेष रूप से सीकम में।

संक्रमित जानवरों से 100 मिलियन से एक अरब कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों के विशिष्ट रोगजनक बोझ को प्रति ग्राम सीकम वसूला जा सकता है, जबकि 10 हजार कॉलोनी बनाने वाली इकाइयों को आमतौर पर तिल्ली के प्रति ग्राम वसूल किया जा सकता है। पिरोसिरियस लाल दाग वाले सेकल खंडों में फाइब्रोसिस का आकलन संक्रमण के 21 दिनों बाद पीक फाइब्रोसिस को इंगित करता है, जबकि अधिकांश विकृति संक्रमण के बाद दिन से हल हो जाती है। सामग्री की पूरी तरह से तैयारी आवश्यक है क्योंकि इस प्रयोग को स्थापित करने के लिए कई दिनों की आवश्यकता होती है।

एलबी प्लेटों और साल्मोनेला और स्ट्रेप्टोमाइसिन की तैयारी सभी को उपयुक्त रूप से किया जाना चाहिए। प्रयोग से पहले, यह सुनिश्चित करें कि प्रयोगकर्ता पशु प्रोटोकॉल के साथ-साथ सुरक्षा खतरों से परिचित है। कोलेजन बोझ का आकलन करने पर, प्रयोगकर्ता अन्य जैविक परख करने का विकल्प चुन सकता है, जैसे कि जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल का आकलन करने के लिए आरएनए अनुक्रमण या प्रतिरक्षा कोशिका सबसेट या एक ऊतक एलिसा का आकलन करने के लिए साइटोकिन प्रोफाइल का आकलन करने के लिए साइटोमेट्री प्रवाह।

तो हमारा मॉडल क्रोन की बीमारी नामक मानव रोग की नकल करने में विशेष रूप से अच्छा है, जहां आपको आंत का फाइब्रोसिस मिलता है, जो काफी हद तक अनुपचारित है और एकमात्र तरीका आप इसका इलाज कर सकते हैं, आंत के एक वर्ग को हटाना और इसे वापस एक साथ सिलाई करना और आशा है कि यह वापस नहीं आता है। हमारा मॉडल बहुत मजबूत है और हमने पहले ही दिखा दिया है कि जन्मजात लिम्फोइड कोशिकाओं को लक्षित करना तीन प्रकार, एक ट्रांसक्रिप्शन कारक जिसे कच्चा अल्फा कहा जाता है, या इंटरल्यूकिन 17 रोग को सुधारता है और फाइब्रोसिस को रोकता है। हमारा मॉडल उन कारकों की पहचान करने में विशेष रूप से अच्छा है जो क्रोन की बीमारी और आंत फाइब्रोसिस के रोगजनन में खेलते हैं और हम पहले से ही कई लक्ष्यों की पहचान करने के लिए सड़क पर हैं जिन्हें भड़काऊ आंत्र रोग को कम करने के लिए चिकित्सकीय रूप से इलाज किया जा सकता है।

हमारा मॉडल पहले से ही एक ही ILC3 या अल्फा NIL17 का उपयोग अन्य फाइब्रोटिक रोग में खेलने पर हो सकता है और इनमें सोरायसिस, मल्टीपल स्क्लेरोसिस, इडियोपैथिक पल्मोनरी फाइब्रोसिस जैसी चीजें शामिल हैं। तो यह संभव है कि इन एक ही कारकों को लक्षित करने के रूप में अच्छी तरह से उन रोगों में फाइब्रोसिस को कम हो सकता है । हालांकि उत्परिवर्ती साल्मोनेला स्ट्रीम उग्र नहीं है, यह सुविधा द्वारा दिए गए मानक बायोहैजार्ड सुरक्षा प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

इसके अलावा, चूंकि फॉर्मलडिहाइड वाष्प को कैंसरजनक माना जाता है, इसलिए निर्धारण चरण के दौरान धूम हुड के पीछे काम करना महत्वपूर्ण है।