Developmental Biology
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एक Drosophila विंग डिस्क से इमेजिंग Dpp रिलीज
Chapters
Summary October 30th, 2019
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लिगन्ड्स के संपर्क में आने का समय उनके विकासात्मक परिणामों को प्रभावित कर सकता है। यहाँ हम दिखाने के लिए कैसे एक Drosophila हड्डी morphogenetic प्रोटीन की छवि जारी करने के लिए (BMP) विंग डिस्क की कोशिकाओं से Dpp बुलाया.
Transcript
डीपीपी बाध्यकारी रिसेप्टर्स द्वारा सेल भाग्य को प्रभावित करता है और प्रतिलेखन को प्रभावित करने के लिए एक संकेत इंट्रासेल्युलर भेजता है। यदि डीपीपी का उत्पादन किया जाता है लेकिन जारी नहीं किया जाता है, तो इसमें रिसेप्टर्स तक पहुंच नहीं है और इसलिए अपनी भूमिकाएं नहीं कर सकते हैं । इस तकनीक से डीपीपी रिलीज की कल्पना करना संभव हो जाता है जिससे शोधकर्ताओं को यह जांचने में सक्षम बनाया जा सके कि कौन से आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारक डीपीपी रिलीज गतिशीलता को बदलते हैं।
बीएमपी सिग्नलिंग मार्ग मक्खियों से मनुष्यों के लिए संरक्षित है इसलिए हम उम्मीद करते हैं कि डीपीपी रिलीज को तय करने वाला तंत्र मानव विकास और उत्थान के लिए भी प्रासंगिक होगा। 10 से 15 पुरुष यूएएस डीपीपी-जीएफपी मक्खियों के साथ 30 से 40 कुंवारी महिला डीपीपी GAL4 मक्खियों को पार करके शुरू करें। भोजन की एक ताजा शीशी में खमीर पेस्ट की एक छोटी राशि जोड़कर अंडे बिछाने को प्रोत्साहित करें।
अंडे इकट्ठा करने के लिए, पार की गई मक्खियों को शीशी में फ्लिप करें और उन्हें हटाने से पहले तीन से चार घंटे तक रखने की अनुमति दें। अंडे संग्रह शीशियों को लगभग 144 घंटे तक 25 डिग्री सेल्सियस पर रखें जब तक कि लार्वा तीसरे इंस्टार चरण में न हो जाए। फिर विच्छेदन के लिए उपयुक्त लार्वा का चयन करें।
सबसे पहले, ऐसे लार्वा का चयन करें जो गैर-टीबी हैं जो कम और वसा के बजाय सामान्य लंबाई होगी। लार्वा व्यक्त करने वाले डीपीपी-जीएफपी का चयन करने के लिए, उन्हें फ्लोरेसेंस स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत देखें। सभी गैर-टीबी लार्वा में कुछ फ्लोरेसेंस होगा, लेकिन जीएफपी विंग डिस्क तक सीमित है और डीपीपी-जीएफपी लार्वा पर कम उज्ज्वल है।
पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार संशोधित HL3 मीडिया तैयार करें जो विंग डिस्क को इमेजिंग के लिए जीवित रखेगा। एचईपीई के साथ पीएच को 7.1 पर समायोजित करें फिर इसे 0.22 माइक्रोमीटर फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें। एक माइक्रोस्कोप स्लाइड भर में बेरंग डबल तरफा टेप चौड़ाई के दो टुकड़े रखें जो उनके बीच लगभग पांच मिलीमीटर की जगह छोड़ते हैं और यह सुनिश्चित करते हैं कि टेप के सिरों को स्लाइड के किनारों के साथ फ्लश किया जाए।
स्लाइड करने के लिए मजबूती से टेप दबाने के लिए एक फ्लैट किनारे का प्रयोग करें। टेप के दो टुकड़ों के बीच संशोधित HL3 मीडिया के 25 माइक्रोलीटर जोड़ें । जब विंग डिस्क मीडिया में घुड़सवार हो जाएगा, टेप के टुकड़े इसे कवरस्लिप द्वारा कुचल दिया जा रहा से रोक देगा ।
लार्वा को विच्छेदन करने के लिए, इसे संशोधित एचएल 3 मीडिया में रखें और धीरे-धीरे दो जोड़े संदंश का उपयोग करके इसे आधे में फाड़ दें। पीछे के आधे को त्यागें, फिर एक जोड़ी संदंश के साथ पूर्वकाल के आधे के बीच को समझें और मुंह के हुक को लार्वा में वापस धकेलने के लिए दूसरी जोड़ी का उपयोग करें जब तक कि यह पूरी तरह से उलटा न हो जाए। लार्वा के दोनों किनारों को चलाने वाले श्वासनली की दो गहरे रंग की प्राथमिक शाखाओं में तेज झुकता की तलाश करें।
विंग डिस्क सीधे नीचे झूठ बोलते हैं। धीरे से डिस्क को हटा दें और उन्हें तैयार स्लाइड पर HL3 मीडिया में डाल यकीन है कि श्वासनली के कोई टुकड़े अभी भी डिस्क से जुड़े रहे हैं । विंग डिस्क को व्यवस्थित करें ताकि विंग पाउच के पेरिपोशियल साइड को फ्लैट में लेटे डिस्क के साथ ऊपर की ओर का सामना करना पड़ रहा है।
नेल पॉलिश के साथ एक कवरस्लिप और सील के साथ पंख को कवर करें। एक बार पॉलिश सूखी होने के बाद, तुरंत इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें। छवि एक 40X तेल उद्देश्य और एक 488 नैनोमीटर लेजर के साथ एक कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग कर घुड़सवार विंग डिस्क।
दो मिनट के लिए दो हर्ट्ज की गति से छवियों को ले लीजिए। सर्वोत्तम परिणामों के लिए, लेजर शक्ति को सेट करें जो ब्लीचिंग से बचने के लिए डीपीपी-रिलीजिंग कोशिकाओं की स्पष्ट छवि प्राप्त करने के लिए पर्याप्त मजबूत है। एक समय श्रृंखला के रूप में छवियों को इकट्ठा करें और डीपीपी रिलीज का वीडियो प्राप्त करने के लिए उन्हें AVI फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें।
जब प्रोटोकॉल सफल होता है, तो डीपीपी-जीएफपी गैर-फ्लोरोसेंट हलकों के रूप में दिखाई देने वाले नाभिक के साथ विंग डिस्क के केंद्र के नीचे एक धारी के रूप में दिखाई देता है। डीपीपी-जीएफपी रिलीज फ्लोरोसेंट पंचेक्टा के रूप में दिखाई देती है जो सेल निकायों से दोनों में और दूर दिखाई देती है और गायब हो जाती है। साइटोनम्स में या साइटोनम्स सिनेप्स में अलग-अलग समय्टा की संभावना होती है।
विंग डिस्क को माउंट किया जाता है ताकि इमेजिंग पेरिपोशियल साइड से की जाए। यदि विंग डिस्क रिवर्स साइड से चित्रित किया गया है, तो डीपीपी-जीएफपी फ्लोरेसेंस फोकस से बाहर दिखाई देगा और संकल्प खराब होगा। जब जीएफपी को डीपीपी से नहीं जोड़ा जाता है, तो सेल निकायों के बाहर कोई समय्टा नहीं देखा जाता है।
यह नियंत्रण दर्शाता है कि डीपीपी-जीएफपी अकेले जीएफपी की तुलना में अलग व्यवहार करता है। इसके अलावा, जब डीपीपी-जीएफपी व्यक्त नहीं किया जाता है तो कोई फ्लोरोसेंट विराम दिखाई नहीं देता है। इस प्रक्रिया के दौरान, यह महत्वपूर्ण है कि विंग डिस्क पेरिपोशियल साइड ऊपर घुड़सवार है।
यदि विंग डिस्क अनुचित रूप से उन्मुख है, तो डीपीपी-जीएफपी ध्यान से बाहर दिखाई देगा। इस विधि का उपयोग विंगलेस या हेजहोग जैसे अन्य विकासात्मक सिग्नलिंग लिगामेंट्स की रिहाई का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। हम सभी विभिन्न पर्यावरणीय और आनुवंशिक कारकों का पता लगा सकते हैं जो डीपीपी रिलीज को प्रभावित कर सकते हैं।
इसके अलावा, हम अन्य सेल प्रकारों से बीएमपी रिलीज का अध्ययन करने के लिए इस विधि को अनुकूलित कर सकते हैं।
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