Biochemistry
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कोलेस्ट्रॉल के साथ स्तनधारी ऊतकों और ज़ेनोपस ओसाइट्स का संवर्धन
Chapters
Summary March 25th, 2020
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कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के दो तरीके प्रस्तुत किए जाते हैं: स्तनधारी ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त साइक्लोडेक्स्ट्रिन का अनुप्रयोग, और ज़ेनोपस ओसाइट्स को समृद्ध करने के लिए कोलेस्ट्रॉल-समृद्ध फॉस्फोलिपिड-आधारित फैलाव (लिपोसोम) का उपयोग। ये विधियां आणविक, सेलुलर और अंग समारोह में ऊंचा कोलेस्ट्रॉल के स्तर के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं।
Transcript
ऊंचा कोलेस्ट्रॉल हृदय और न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के लिए एक प्रमुख जोखिम कारक है। हमारे प्रोटोकॉल हाइपरकोलेस्टेरियोलिमिया के शारीरिक और मशीनी दोनों परिणामों का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण प्रदान करते हैं। इन प्रक्रियाओं को बुनियादी प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करके किया जा सकता है, और कोशिकाओं, ऊतकों और ज़ेनोपस ओसाइट्स पर लागू होता है।
कोलेस्ट्रॉल पूरे शरीर में सेलुलर झिल्ली का एक प्रमुख घटक है। इन तकनीकों का उपयोग किसी भी कोशिका प्रकार में कोलेस्ट्रॉल के ऊंचा स्तर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। धमनियों को विच्छेदन करना सबसे कठिन कदम है।
ध्यान से मस्तिष्क से धमनी को हटा दें, बिना खींच या संवहनी ऊतक को नुकसान पहुंचाए। लिपिड बहुत नाजुक हैं, और उनके साथ काम करना एक विज्ञान की तुलना में एक कला का अधिक है। वीडियो प्रदर्शन कैसे लिपिड को ध्यान से संभालने के लिए सीखने के लिए एक गाइड प्रदान करता है ।
कोलेस्ट्रॉल सैचुरेटेड मिथाइल-बीटा-साइक्लोडेक्स्ट्रि सॉल्यूशन तैयार करने के लिए सबसे पहले 064 ग्राम मिथाइल-बीटा-साइक्लोडेक्स्ट्रि को 10 मिलीलीटर पीबीएस में डालें, जो कि एक हलचल बार के साथ समाधान को हिलाते हैं, ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि मिथाइल-बीटा-साइक्लोडेक्सट्रिन पूरी तरह से घुल जाए। इसके बाद, फ्लास्क में 0024 ग्राम कोलेस्ट्रॉल पाउडर जोड़ें, और समाधान को तेजी से हिलाएं, एक स्पैटुला का उपयोग करके जितना संभव हो उतने कोलेस्ट्रॉल के हिस्से को तोड़ने के लिए। जब लगभग सभी कोलेस्ट्रॉल भंग हो गया है, पैराफिन फिल्म की कम से कम दो परतों के साथ फ्लास्क सील।
और रात भर ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में प्रति मिनट के बारे में 30 दोलनों पर फ्लास्क हिला । आठ से 16 घंटे के बाद, एक वर्ग की बोतल में एक 22 माइक्रोमीटर पॉलीएथर्सल्फोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से मिश्रण को छानने से पहले, कमरे के तापमान के समाधान को ठंडा करें। स्तनधारी मस्तिष्क धमनी संवर्धन के लिए, एक २५० से ३०० ग्राम Sprague Dawley चूहा बर्फ पर PBS के एक बीकर में मस्तिष्क फसल, एक लच्छेदार विच्छेदन कटोरा में मस्तिष्क स्थानांतरित करने से पहले, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, बस पर्याप्त PBS युक्त ऊतक जलमग्न करने के लिए ।
दो से तीन पिन के साथ मस्तिष्क को सुरक्षित करें, सुनिश्चित करें कि वे रक्त वाहिकाओं में प्रवेश नहीं करते हैं। और मस्तिष्क के आधार पर विली के सर्कल बनाने वाली मस्तिष्क धमनियों और उनकी शाखाओं को धीरे-धीरे विच्छेदन करने के लिए तेज संदंश और छोटी सर्जिकल कैंची का उपयोग करें। इसके बाद, ऊतकों को कवर करने के लिए पर्याप्त कोलेस्ट्रॉल समृद्ध समाधान में कुल्ला खंडों को इनक्यूबेट करने से पहले, पीबीएस में एक सेंटीमीटर लंबी धमनी खंडों को संक्षेप में कुल्ला करें।
कोलेस्ट्रॉल के स्तर में किसी भी परिवर्तन को निर्धारित करने के लिए, डिमेथिल सल्फोक्साइड में डाई के 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए फिलिपिन पाउडर की एक ताजा बोतल का उपयोग करें, और ताजा पीबीएस में तीन पांच मिनट की धोता के साथ कोलेस्ट्रॉल समृद्ध ऊतकों को धोएं। अंतिम धोने के बाद, धमनी खंडों को 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में बर्फ पर 15 मिनट के लिए ठीक करें, प्रकाश से संरक्षित, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 5% ट्राइटन में नमूनों को पार करने से पहले। इनक्यूबेशन के अंत में, एक शेखर पर पीबीएस में तीन पांच मिनट की धुलाई के साथ ऊतकों को धोएं, नमूनों को 25 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर अंतिम एकाग्रता में जोड़ने से पहले, कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए, प्रकाश से संरक्षित।
इनक्यूबेशन के अंत में, धमनी के टुकड़ों को तीन बार धोएं, जिसके बाद आसुत पानी के साथ एक संक्षिप्त कुल्ला किया गया। अंतिम धोने के बाद, किसी भी अतिरिक्त तरल को अवशोषित करने के लिए एक प्रयोगशाला ऊतक का उपयोग करें, और एक उपयुक्त बढ़ते माध्यम का उपयोग करके धमनियों को स्लाइड पर माउंट करें। ध्यान से एक कवर पर्ची के साथ धमनियों को कवर, रोलिंग या ऊतक के घुमा से बचने के लिए ध्यान रखना, और स्लाइड कमरे के तापमान पर 24 घंटे के लिए सूखी, प्रकाश से संरक्षित करते हैं ।
जब बढ़ते माध्यम सूखी है, स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ कवर पर्ची किनारों सील, और पॉलिश 10 से 15 मिनट के लिए सूखने के लिए अनुमति देते हैं । फिर, 340 से 380 नैनोमीटर की उत्तेजन के साथ ऊतक की छवि, और 385 से 470 नैनोमीटर का उत्सर्जन। फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव तैयार करने के लिए 10 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म भंग लिपिड सॉल्यूशन, एल-अल्फा-फॉस्फेटिडिलेथेनहामाइन, 1-पामिटोइल-2-ओलिओइल-एसएन-ग्लाइसेरो-3-फॉस्फोकोलिन और कोलेस्ट्रॉल के 200 माइक्रोलीटर को 12 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब में मिलाएं।
नाइट्रोजन की एक धारा के तहत हुड में क्लोरोफॉर्म वाष्पित, बफर 150 मिलीमोलर पोटेशियम क्लोराइड और 10 मिलीमोलर ट्रिस एचईपीएस समाधान के 800 माइक्रोलीटर में लिपिड को निलंबित करने से पहले। फिर पैराफिन फिल्म के साथ ट्यूब को सील करें, और धीरे-धीरे 80 किलोहर्ट्ज पर ट्यूब सामग्री को 10 मिनट के लिए सोनिकेट करें, जब तक कि दूधिया मिश्रण न बन जाए। ज़ेनोपस ओसाइट्स के कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के लिए, कई क्षेत्रों में एक मादा ज़ेनोपस लेविस मेंढक से अंडाशय थैली को बाधित करने के लिए तेज संदंश का उपयोग करें, और अंडाशय के हिस्से को 60 मिलीमीटर प्लेट में रखें जिसमें कैल्शियम मुक्त ND96 के पांच मिलीलीटर के साथ कोलेजनेस के 5 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक हो।
कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए प्रति मिनट 60 दोलनों पर एक कक्षीय शेखर पर ऊतक हिलाएं। इनक्यूबेशन के अंत में, व्यक्तिगत ओसाइट्स को अलग करने के लिए पांच से 10 बार समाधान युक्त ओसाइट युक्त ओसाइट को सख्ती से पिपेट करने के लिए एक विस्तृत टिप के साथ एक स्थानांतरण पिपेट का उपयोग करें, और समाधान पारदर्शी होने तक ताजा कैल्शियम मुक्त ND96 के साथ अंधेरे ओसाइट समाधान को जल्दी से कुल्ला करें। इसके बाद, कोलेस्ट्रॉल समृद्ध फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव के 90 माइक्रोलीटर को 96 अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में स्थानांतरित करें, और जितना संभव हो उतना कम माध्यम के साथ अच्छी तरह से छह ओसाइट्स तक जोड़ें।
पांच से 10 मिनट के लिए एक तीन आयामी मंच रोटेटर पर ९६ अच्छी तरह से थाली रखें । फिर कुएं में ND96 की एक बूंद जोड़ें, और कोलेस्ट्रॉल समृद्ध oocytes को उनके तत्काल विश्लेषण के लिए ND96 युक्त 35 मिलीमीटर प्लेट में स्थानांतरित करें। यहां, एक इमेज्ड सेरेब्रल धमनी चिकनी मांसपेशियों की परत का एक उदाहरण कोलेस्ट्रॉल की बढ़ती सांद्रता के साथ ऊतक संवर्धन पर प्राप्त फिलिपिन संबद्ध फ्लोरेसेंस में एकाग्रता निर्भर वृद्धि को दर्शाता है।
विशेष रूप से तीन घंटे मिथाइल-बीटा-साइक्लोडेक्स्ट्रिन कोलेस्ट्रॉल जटिल के साथ उपचार के बाद कोलेस्ट्रॉल के स्तर में समृद्धि के तुरंत बाद उनके स्तर की तुलना में लगभग 50% की कमी आई। जबकि एक घंटे इनक्यूबेशन समय आमतौर पर इस दृष्टिकोण के दौरान कोलेस्ट्रॉल के साथ ऊतकों और कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है, इनक्यूबेशन के पांच मिनट आमतौर पर कोलेस्ट्रॉल ऑक्सीडेस आधारित जैव रासायनिक परख द्वारा निर्धारित मस्तिष्क धमनी कोलेस्ट्रॉल सामग्री में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि को प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है । हालांकि कोलेस्ट्रॉल की कमी नियंत्रण फॉस्फोलिपिड आधारित फैलाव से समृद्ध ज़ेनोपस ओसाइट्स में कोलेस्ट्रॉल के स्तर में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं देखा जाता है, लेकिन कोलेस्ट्रॉल आधारित फैलाव के साथ केवल पांच मिनट के उपचार के बाद कोलेस्ट्रॉल का स्तर काफी बढ़ जाता है जिसमें कोलेस्ट्रॉल शामिल होता है, और इस स्तर पर रहता है जब इनक्यूबेशन समय 60 मिनट तक बढ़ जाता है।
कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए साइक्लोडेक्स्ट्रिन आधारित दृष्टिकोण की प्रभावशीलता भी हिप्पोकैम्पस के CA1 क्षेत्र से ताजा अलग न्यूरॉन्स में प्रदर्शित की जाती है। दरअसल, मिथाइल-बीटा-साइक्लोडेक्सट्रिन में न्यूरॉन्स के इनक्यूबेशन ६० मिनट के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ संतृप्त कोलेस्ट्रॉल के स्तर में दो गुना से अधिक वृद्धि हुई है, के रूप में फिलिपिन से जुड़े फ्लोरेसेंस द्वारा मूल्यांकन किया । कुल मिलाकर, इन प्रक्रियाओं के लिए दो सबसे महत्वपूर्ण कदम कोलेस्ट्रॉल संवर्धन मिश्रण तैयार कर रहे है और धमनी ऊतक की अखंडता सुनिश्चित करने ।
कोलेस्ट्रॉल संवर्धन के बाद, कोई भी हाइपरकोलेस्टेरियोमिया से प्रभावित प्रोटीन के कार्य का अध्ययन कर सकता है। कोलेस्ट्रॉल के साथ कोशिकाओं को समृद्ध करने की क्षमता कार्डियोमायोसाइट्स और न्यूरॉन्स में ऊंचा कोलेस्ट्रॉल के स्तर के अध्ययन की सुविधा । oocytes के उपयोग ने हमें यह जांचने की अनुमति दी कि कोलेस्ट्रॉल आयन चैनलों को कैसे बांधता है।
एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने वह हमेशा इस प्रोटोकॉल के लिए पहना जा सकता है । क्लोरोफॉर्म और पैराफॉर्मलडिहाइड का उपयोग धूम हुड के नीचे किया जाना चाहिए और इसे खतरनाक कचरे के रूप में त्याग दिया जाना चाहिए।
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