Biology
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Aislamiento y caracterización de fibroblastos cardíacos adultos y miofibroblastos
Chapters
Summary March 12th, 2020
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La obtención de una población pura de fibroblastos es crucial para estudiar su papel en la reparación de heridas y fibrosis. Aquí se describe un método detallado para aislar fibroblastos y miofibroblastos de corazones de ratón no lesionados y lesionados seguidos de la caracterización de su pureza y funcionalidad por inmunofluorescencia, RTPCR, clasificación celular asistida por fluorescencia, y contracción del gel de colágeno.
Transcript
Este protocolo nos permite aislar poblaciones de fibroblastos activados tanto en reposo como por lesiones con una pureza significativa. La principal ventaja de esta técnica es su flexibilidad para la improvisación. Para el flujo, así como el aislamiento basado en cuentas, se pueden incorporar anticuerpos contra las células contaminantes para excluirlos de las células diana aisladas.
Esta técnica se utiliza principalmente para el aislamiento de fibroblastos cardíacos. Sin embargo, se puede utilizar para aislar fibroblastos de otros tejidos. Demostrar este procedimiento será Meiling Melzer, un pasante de pregrado, y David Beier, un asistente de investigación de mi laboratorio.
Para preparar una placa de seis pocillos para almacenar seis corazones durante la disección, prescinda dos mililitros de KHB frío en cada pozo y coloque la placa sobre hielo. Rocíe el cuerpo con 70%etanol. Orientarlo para que el lado ventral esté frente al experimentador.
Ancle los apéndices para evitar interferencias. Sin perforar el hígado, abrir la piel abdominal y el músculo. Corte verticalmente hacia el esternón, abriendo cuidadosamente el tórax sin perforar el corazón.
A continuación, continúe cortando a través de la caja torácica para exponer el corazón. Usando fórceps, levante suavemente el corazón del pecho, cortando cualquier pulmón o exceso de tejido unido al exterior del corazón. Separe el ventrículo izquierdo.
Para cada disección, coloque el ventrículo en un pozo separado de la placa de seis pocillos. En primer lugar, utilice fórceps para exprimir y agitar repetidamente el ventrículo en KHB para eliminar el exceso de sangre. Transfiera el ventrículo a una placa limpia, estéril de 10 centímetros cuadrados.
A continuación, usando una hoja de un solo filo, picar rápidamente el ventrículo en trozos pequeños. Añadir un mililitro de cóctel de digestión de colagenasa, y continuar la picadura. Cuando las piezas sean lo suficientemente pequeñas como para transferirlas con una micropipeta de un mililitro, transfiéralas a un tubo cónico de 50 mililitros.
Lave el plato dos veces con dos mililitros de cóctel y transfiera el lavado al tubo. Incubar el tubo durante 30 minutos, y resuspender las células como se describe en el manuscrito utilizando una pipeta de cinco mililitros. Después de la resuspensión inicial, incubar las células durante 15 minutos y resuspend de nuevo usando una pipeta de 10 mililitros.
Luego, coloca un colador celular de 40 micrómetros encima de un nuevo tubo cónico de 50 mililitros, y prepara el colador mojándolo con uno o dos mililitros de KHB. Añadir 25 mililitros de KHB a la suspensión de digestión, y resuspend. Filtrar la suspensión a través del colador, reemplazando el colador según sea necesario.
Centrifugar el filtrado a 400 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Retire el sobrenadante y resuspendir el pellet en tampón de lisis 1x RBC usando cinco mililitros de tampón por corazón. Después de incubar la suspensión durante dos minutos a temperatura ambiente, centrifugar la suspensión a 400 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Retire el sobrenadante, y luego resuspender el pellet en un mililitro de KHB. A continuación, agregue nueve mililitros de KHB a la suspensión. Filtre la suspensión a través de un colador celular cebado de 40 micrómetros en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.
Centrifugar el tubo cónico a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, retire el sobrenadante, y resuspendir el pellet en un mililitro de medios de fibroblastos o PBS. Una vez determinado el número de célula, los fibroblastos pueden aislarse de la suspensión mediante tres métodos diferentes descritos en el manuscrito.
Para comenzar el aislamiento por revestimiento diferencial, prepare una placa de seis pozos añadiendo dos mililitros de medios de fibroblastos a cada pozo. Gire la placa para cubrir los fondos de los pozos. Si las células cardíacas del ratón están suspendidas en PBS, centrifugarlas y resuspenderlas en un mililitro de medios de fibroblastos por corazón.
Añadir un mililitro de suspensión celular, el equivalente de un corazón, a cada pozo. Gire la placa para distribuir uniformemente las células. Agregue de uno a dos mililitros adicionales de medios de fibroblastos por pozo para un volumen total de hasta cuatro mililitros por pozo.
Incubar a 37 grados centígrados durante cuatro horas. Debido a que los fibroblastos se adhieren selectivamente a los pozos, se pueden aislar mediante la eliminación y descarte de los medios. Lave las células unidas restantes con dos mililitros de PBS, y luego agregue dos a cuatro mililitros de medios de fibroblastos estériles por pozo.
Incubar a 37 grados hasta confluencia, cambiando los medios cada dos a cuatro días. Para comenzar el etiquetado magnético y la separación de las células hematopoyéticas CD45 positivas, centrifugar una suspensión de las células cardíacas del ratón a 500 veces g durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y resusppend el pellet celular en un mililitro de tampón de equilibrio.
Cuente las células usando un hemocicómetro. Después de centrifugar las células de nuevo, resuspender el pellet celular en el tampón de equilibrio. Agregue perlas magnéticas CD45 positivas y mezcle bien.
Incubar durante al menos 15 minutos a cuatro grados centígrados. Lave las células añadiendo tampón de equilibrio y centrifugando a 500 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y cuente las células usando un hemociclomekil.
Resuspender el pellet en el tampón de equilibrio. Pase la suspensión a través de un filtro de 40 micrómetros para evitar que las agregaciones celulares obstruyan la columna de separación. A continuación, coloque una columna de separación en el campo magnético de un separador adecuado y equilibre la columna con al menos tres mililitros de PBS.
Vierta la suspensión celular a través de la columna, y recoja el flujo a través, que contendrá las células sin etiquetar, en un tubo cónico de 15 mililitros. Lave la columna tres veces con tres mililitros de tampón de equilibrio y combine los lavados con el flujo a través. Retire la columna del separador y coloque la columna en un tubo cónico de 15 mililitros.
Para eluir las celdas CD45 positivas etiquetadas, pipetee cinco mililitros de búfer de equilibrio en la columna y sumerja la columna firmemente. Centrifugar el tubo de eluyente y el tubo de flujo a través a 500 veces g. Cuente las células usando un hemocicómetro.
Para completar el aislamiento, siga los protocolos del manuscrito para las células endoteliales CD31 positivas y los fibroblastos positivos MEFSK4, que son similares al protocolo para las células CD45 positivas. La clasificación de células activada por fluorescencia se realizó en células individuales aisladas de corazones de ratón alfa-SMA-GFP después del infarto de miocardio. Un esquema representativo de medición demuestra células positivas de la GFP que co-expresan CD31, CD45 o AN2.
En los corazones lesionados del ratón, un pequeño porcentaje de células endoteliales y células hematopoyéticas expresaron GFP. Sin embargo, las células GFP-positivas/CD31-negativas/CD45-negativas no expresaron AN2, un marcador de pericito. Células GFP positivas expresaron alfa-SMA, colágeno uno alfa, periostina, y vimentina.
Los fibroblastos no lesionados aislados por adhesión selectiva expresaron vimentina, pero no demostraron la expresión de alfa-SMA, periostina o colágeno uno alfa. Tanto los fibroblastos no lesionados como los activados expresaron el antígeno MEFSK4. Tanto los fibroblastos no lesionados, aislados por adherencia selectiva, como los miofibroblastos, aislados y clasificados de ratones alfa-SMA-GFP, demostraron una capacidad para contraer colágeno.
Es importante picar el tejido a fondo antes de la incubación. Antes de la separación basada en cuentas, es importante pasar la suspensión a través de un filtro de 40 micrómetros para evitar agregaciones celulares. Las células purificadas por este método podrían purificarse aún más utilizando perlas magnéticas asociadas con anticuerpos específicos de pericitos para asegurar un alto nivel de pureza.
Con la disponibilidad de nuevos anticuerpos conjugados con cuentas, así como ratones transgénicos reporteros, uno puede utilizar estas técnicas para aislar y estudiar poblaciones celulares distintas, no sólo fibroblastos.
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