Inflado al aire de los pulmones murinos con fijación de perfusión vascular

Este es un método económico que combina las ventajas de la inflación del aire y la fijación de perfusión vascular para preservar los pulmones para análisis estructurales y funcionales. La principal ventaja de esta técnica es la preservación tanto de la morfología celular como de la ubicación dentro de los espacios aéreos del pulmón. Se debe tener cuidado al colocar el adaptador de talón de señuelo en la tráquea y la aguja de perfusión en el ventrículo derecho para garantizar un inflado y una fijación adecuados.

Para configurar el aparato de inflado de aire, coloque una jeringa para la columna de agua en un soporte de anillo y mida una altura vertical de 25 centímetros desde la plataforma del animal hasta 25 centímetros en la columna de agua. Fije al extremo del tubo de la columna de agua a la llave de paso en la cámara de aire y conecte un tubo desde el señuelo hembra de la cámara de aire a la llave de paso en el contenedor de procesamiento de animales. Confirme que la tapa de la cámara de aire y la llave de paso en el exterior del recipiente de procesamiento de animales están cerradas, y que la llave de paso en el tubo que va desde la columna de agua hasta la cámara de inflado de aire está abierta.

Luego llene la jeringa con agua hasta la marca de 25 centímetros. El agua fluirá a través de la jeringa y el tubo hacia la cámara de aire. Una vez que se iguala la presión, el agua dejará de fluir.

Para preparar los pulmones para la inflación, haga una incisión lateral en la pared abdominal debajo de la caja torácica del ratón sacrificado, y una segunda incisión de la pared abdominal lateral por encima de las caderas. Corte a lo largo de la línea media desde la incisión interior hacia la incisión superior, y use tijeras romas para hacer cuidadosamente una incisión en el lado lateral del diafragma. Los pulmones deben colapsar tan pronto como se perfora el diafragma.

Corte transversalmente a lo largo del diafragma para abrir la cavidad torácica y corte superiormente a lo largo del esternón desde el proceso xifoide hasta la muesca del malabarista, y lateralmente por encima de la caja torácica para exponer completamente el corazón y los pulmones. Fije los lados de la caja torácica y haga una incisión en la línea media en el cuello, por encima de la tráquea. Retire la piel, el músculo, la glándula tiroides y el tejido conectivo que rodea la tráquea y use forrórceps curvos para deslizar dos piezas de sutura debajo de la tráquea posterior.

Use una pieza de sutura para mantener el adaptador de talón de señuelo de inflado en su lugar y use una aguja de calibre 18 por una pulgada para hacer un pequeño agujero en la tráquea. Inserte un adaptador de talón de señuelo de calibre 20 en el orificio y ate la sutura alrededor de la tráquea inmediatamente distal a donde el adoptante del talón de señuelo entra en el orificio. Luego transfiera el animal al contenedor de procesamiento de animales y conecte el adaptador de talón de señuelo al señuelo hembra en el interior del contenedor de procesamiento de animales.

Para inflar los pulmones, coloque la aguja de calibre 25 por 5/8 de pulgada unida al tubo del aparato de perfusión en el ventrículo derecho del corazón y corte la aorta abdominal para permitir que la sangre drene del corazón y para promover el flujo de perfusato a través de los pulmones. Abra la llave de paso en el exterior del recipiente de procesamiento de animales e infle los pulmones a 25 centímetros de agua durante cinco minutos, mientras cuida que el nivel de agua en la jeringa no disminuya demasiado rápido. Durante el último minuto de la inflación pulmonar, encienda la bomba peristáltica a un caudal de 10 mililitros por minuto.

La solución de heparina debe fluir desde la botella a través del tubo hacia el animal. Después de inflar los pulmones durante cinco minutos, apague la bomba y cambie el perfusato de heparina a fijador. Baje la jeringa de la columna de agua a 20 centímetros.

Es normal que las burbujas de aire se muevan dentro de la columna de agua a medida que cambia la presión. Compruebe el nivel de agua en la jeringa. Debe estar en la marca de 25 centímetros.

Luego espere un minuto para permitir que los pulmones se desinflen de 25 a 20 centímetros de presión de agua antes de reiniciar la bomba a una velocidad de flujo de 6.5 mililitros por minuto durante 10 a 15 minutos, perfusión fijadora vascular. Para la extracción del tejido pulmonar inflado y fijo, ate firmemente el segundo trozo de hilo alrededor de la tráquea, distal al adaptador de talón de señuelo y retire el adaptador de talón de señuelo de la tráquea. Retire la aguja del corazón y use tijeras romas para cortar el tejido conectivo, posterior al mediastino, para liberar los pulmones y el corazón de la cavidad torácica teniendo cuidado de evitar perforar los pulmones.

Retire cuidadosamente el corazón de los pulmones y coloque los pulmones en 20 a 25 mililitros de fijador en un tubo cónico de 50 mililitros. Tire de la sutura que sostiene la tráquea a través de la abertura en el tubo cónico y asegure la sutura por los hilos de la tapa. Luego invierta el tubo para asegurarse de que los pulmones flotantes e inflados por aire permanezcan completamente sumergidos en fijador y procese los pulmones para estudios histológicos de acuerdo con los protocolos estándar.

Cuando se ingresa el diafragma durante la disección, la integridad del espacio pleural será abolida y los pulmones colapsarán. Tras la aplicación de 25 centímetros de presión de agua, el aire entrará en los pulmones a través de la tráquea y la inflación debe observarse fácilmente. Una vez que los pulmones se han expandido completamente, la presión de inflado se puede reducir a 20 centímetros para mantener los pulmones inflados sin una distensión excesiva.

Los pulmones deben permanecer inflados después de la ligadura traqueal y la extracción del tórax. La deflación puede ocurrir si los pulmones se perforan durante la preparación animal o la extracción pulmonar. El análisis histológico de las secciones pulmonares infladas revela que muy pocas células inmunes están presentes en la luz de las vías respiratorias de los tejidos fijados utilizando la inflación tradicional a base de líquidos.

Por el contrario, las células inflamatorias se conservan dentro de los espacios aéreos de los tejidos fijados a través de la perfusión vascular con inflado del aire. Después de la inflación del aire con fijación de profusión, el tejido pulmonar puede incrustarse en formalina para la seccionamiento de tejidos y el posterior análisis a través de técnicas histológicas, que incluyen tinción, inmunohistoquímica e imágenes inmunofluorescentes.