Laser micro-bestråling til undersøgelse DNA rekruttering i S fase

Denne protokol hjælper med at forstå den rumlige og tidsmæssige rekruttering af DNA-skader reparation proteiner, under hensyntagen til cellecyklus fase. Til forskelsbehandling af cellecyklus bruger vi fluorescerende proteinmærkede PCNA som en markør for S-fase, som omgår artefakter, der er introduceret af andre metoder til synkronisering af cellecyklus. Dette kombineret med laserbaseret mikrobestråling giver uovertruffen spatiotemporal opløsning til DNA-skader reparation protein kinetics.

Succes i rutinemæssig udnyttelse af vores protokol bygger på grundlæggende viden om confocal billeddannelse. 24 timer før mikrobestrålingen plader i alt otte gange 10 til de fjerde celler i 500 mikroliter til en milliliter medier på et fire-brønds kammerdækselglas. En time før mikrobestrålingen skal det regelmæssige vækstmedium udveksles med billedmedie, der indeholder enten olaparib eller en køretøjskontrol som DMSO.

Mindst fire timer før billeddannelse skal du tænde for miljøkammeret og mikroskopkomponenterne. Tænd for opvarmning, kuldioxidforsyning og fugtighedsregulatoren. Initialiser lyskilder sammen med laserlinjerne mindst en time før cellerne overføres til mikroskopet.

Olie mikroskop mål og placere et chambered dækglas under mikroskopet. Hvis du vil vælge S-faseceller i en asynkron population, skal du kigge gennem okulæret efter det unikke lokaliseringsmønster for det mPlum-mærkede PCNA i S-fasen og vælge et synsfelt, der har nok S-faseceller til mikrobestråling. Angiv området for mikrobestråling ved hjælp af den tilknyttede software til at indsætte binære linjer.

Hvis du vil angive det ønskede antal linjer og mellemrum, skal du klikke på binær, derefter markere indsæt linje, cirkel og ellipse til tegning af det ønskede antal linjer og derefter konvertere disse binære linjer til stimulerings-INVESTERINGSAFKAST ved at klikke på INVESTERINGSAFKAST, flytte binær til INVESTERINGSAFKAST, derefter højreklikke på et af roi’erne og vælge brug som stimulering af ROI S1. Placer disse linjer i synsfeltet, så de passerer gennem kernen af cellerne. Før mikrobestråling, for at identificere PCNA foci til senere analyse, tage en højere opløsning billede af synsfeltet ved at angive de nødvendige parametre i A1 LFOV kompakt GUI og A1 LFOV scanning område vinduer efterfulgt af at trykke på capture-knappen. For at oprette mikro-bestråling, åbne ND stimulation fanen, derefter få adgang til tidsplan vinduet for at erhverve en række pre-stimulation billeder og derefter en række post-stimulation billeder ved hjælp af Galvano scannere.

Konfigurer tre faser i tidsplanlægningsvinduet. I anskaffelses- og stimuleringskolonnen skal du vælge henholdsvis anskaffelse, stimulering og anskaffelse for de tre faser. For stimuleringsfasen skal du indstille S1 som investeringsafkast.

I Galvano XY vinduet, indstille 100% laser effekt for 405 nanometer laser linje og indstille opholdstiden for mikro-bestråling. Hvis du vil konfigurere timelapsebilleddannelse for det ønskede tidsvindue og intervaller, skal du bruge tidsplanen A1 LFOV kompakt GUI og A1 LFOV-scanningsområdets vinduer. Optimer indstillingerne for lasereffektprocent, gain og offset for at reducere fotoblegning under billeddannelse i A1 LFOV-vinduet.

Afhængigt af proteinets kinetika skal du forlænge eller forkorte intervallet mellem billederne eller varigheden af det samlede timelapse ved at indstille det ønskede interval og varighed for den tredje fases anskaffelsesrække i tidsplanlægningsvinduet. Tryk på køre nu for at udføre mikro-bestråling og den efterfølgende timelapse imaging. I slutningen af timelapse imaging, gemme stimulation ROIs som separate billeder, som vil være nyttige til at identificere koordinaterne for mikro-bestråling i enhver downstream software, der anvendes til analyse.

PCNA har en helt homogen fordeling i kernen i G1- og G2-faser. I S fase lokaliserer PCNA til steder med DNA-replikation, som kan visualiseres som lyspunkter i kernen. I tidlige S fase celler, pletterne er relativt små og ligeligt fordelt i hele kernen af cellen.

Mens fremskridt i midten af S fase, pletterne bliver sløret og lokalisere mere mod omkredsen af kernen og nucleoli. I sen S-fase reduceres pletterne i antal, men bliver stadig større, da PCNA koncentrerer sig på sene replikeringssteder. Lave doser af energi, såsom 1.000 mikrosekunder af opholdstid, fremkalder ikke rekruttering af EGFP-FBXL10, en dobbeltstrenget pause responder, men er tilstrækkelige til at fremkalde rekruttering af NTHL1-mCherry, en base excision reparation pathway protein, der rekrutteres til steder med oxidativ DNA-skade.

På 3, 000 mikrosekunder opholde tid, både EGFP-FBXL10 og NTHL1-mCherry er rekrutteret, der viser en laser output, der genererer både oxidative læsioner og dobbelt-strandede pauser. EXO1b når et maksimalt niveau af akkumulerings- og mikrobestrålingssteder omkring et minut og begynder derefter langsomt at frigøre sig fra DNA-læsionerne. I nærværelse af olaparib er akkumuleringen af EXO1b ved laserstriben på et minut betydeligt mindre sammenlignet med køretøjets kontrol.

Det er afgørende, at mikroskopet får rigelig tid til at varme op, og at kultur og betingelser er optimale for hvert eksperiment for at sikre ensartede resultater. Derudover er det vigtigt at optimere dine laserindstillinger med forskellige DNA-skader til at teste for specifikke DNA-læsioner. Efter mikrobestråling kan du overveje at validere resultater med klassiske biokemiske metoder, såsom fraktionering, immunprecipitation eller ChIP.

Disse tilgange stikprøver en større cellepopulation, hvilket giver statistisk styrke.