Name: Van cellen naar celvrije eiwitsynthese binnen 24 uur met behulp van celvrije auto-inductieworkflow (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Leer een vereenvoudigde celvrije auto-inductiemethode voor functionele celextracten uit Escherichia coli. Deze techniek vermindert onderzoekerstoezicht en tijd, waardoor celvrije eiwitsynthese toegankelijker wordt voor breder onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Auteurs willen Dr. Jennifer VanderKelen en Andrea Laubscher bedanken voor technische ondersteuning. Auteurs willen ook Nicole Gregorio, Max Levine, Alissa Mullin, Byungcheol So, August Brookwell, Elizabeth (Lizzy) Vojvoda, Logan Burrington en Jillian Kasman bedanken voor de nuttige discussies. Auteurs erkennen ook de financieringssteun van het Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly en de National Science Foundation (NSF-1708919).

1. Media groei
<ol><li>Bereid 960 ml CFAI-media zoals beschreven in tabel 1 en pas de pH aan op 7,2 met KOH.</li>
	<li>Breng de kweekmedia gedurende 30 minuten bij 121 °C over in een verbijsterde kolf en autoclaaf van 2,5 L.</li>
	<li>Bereid een suikeroplossing van 40 ml zoals beschreven in tabel 1. Filter-steriliseer de oplossing in een aparte geautoclaveerde glazen container. OPMERKING: De suikeroplossing kan tot verder gebruik in een incubator van 30 °C worden bewaard.</li>
	<li>Laat de media na autoclaveren volledig afkoelen tot onder de 40 °C.</li>
	<li>Voeg voorafgaand aan de inenting van de CFAI-media de suikeroplossing rechtstreeks toe aan de CFAI-media.</li>
	<li>Om de media te enten, veegt u een lus vol kolonies van een eerder gestreepte E. coli BL21 Star (DE3) plaat en plaatst u deze rechtstreeks in de media. Draai de lus in het medium, maar raak de zijkanten van de container niet aan. Zorg ervoor dat de streepplaat vers is, met levensvatbare cellen.</li>
	<li>Plaats de kolf met de ingeënte media in een incubator van 30 °C terwijl u bij 200 tpm schudt. Laat de cultuur van de ene op de andere dag groeien. Als cellen 's avonds worden geënt, bereikt de cultuur een geschatte optische dichtheid, gemeten bij 600 nm (OD600), van 10 de volgende ochtend. Inentings- en oogsttijden kunnen indien nodig worden aangepast.</li>
</ol>2. Celoogst
<ol><li>Bereid S30-buffer van tevoren voor en houd deze koud. Bereid de S30-buffer volgens tabel 2 voor op een uiteindelijke pH van 8,2. OPMERKING: De S30-buffer kan dagen voor de celoogst worden voorbereid. Als dit gebeurt, bereid dan zonder dithiothreitol en bewaar bij 4 °C. Voeg dithiothreitol vlak voor gebruik toe.</li>
	<li>Houd vanaf dit punt alle oplossingen en materialen op ijs. Breng 1 L media over in een centrifugefles van 1 L en centrifugeer bij 5.000 x g tussen 4-10 °C gedurende 10 minuten. Decanteer en gooi het supernatant weg. Breng met behulp van een steriele spatel de pellet over in een voorgekoelde en eerder gewogen conische buis van 50 ml.</li>
	<li>Was eenmaal met 30-40 ml koude S30-buffer door de pellet via vortexing in 30 s bursts met rustperioden op ijs opnieuw op te suspenderen. OPMERKING: Vanwege een groter volume pellet kan het splitsen van de celkorrel in twee conische buizen van 50 ml nuttig zijn voor de wasstap. Het opslaan van cellen in kleinere aliquots biedt ook flexibiliteit voor de downstream-verwerking.</li>
	<li>Centrifugeer de celresuspensie bij 5000 x g tussen 4-10 °C gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Gooi het supernatant weg en veeg overtollige van de binnenwanden van de conische buis van 50 ml af met een schoon weefsel, vermijd het aanraken van de pellet zelf. Weeg en vries de pellet in vloeibare stikstof. Bewaren bij -80 °C tot nader gebruik. OPMERKING: Pellets hoeven mogelijk niet te worden ingevroren als de gebruiker van plan is door te gaan met het protocol voor de bereiding van het extract.</li>
</ol>3. Extract bereiding
<ol><li>Combineer de bevroren pellet met 1 ml S30-buffer voor elke 1 g van de celkorrel en laat ongeveer 30-60 minuten op ijs ontdooien. Resuspend ontdooide pellet via vortexing in uitbarstingen van 30 s met rustperiodes op ijs. Vortex totdat er geen zichtbare klonten cellen overblijven. OPMERKING: Kleinere klonten kunnen worden geresuspendeerd door te mengen met behulp van een pipet.</li>
	<li>Breng aliquots van 1,4 ml celresuspensie over in microfugebuizen van 1,5 ml voor cellysis. Soniceer elke buis met een frequentie van 20 kHz en 50% amplitude voor drie uitbarstingen van 45 s met 59 s rust per cyclus omgeven door een ijsbad. Keer de buis tussen de cycli om en voeg onmiddellijk 4,5 μL 1 M dithiothreitol toe na de laatste ultrasoonapparaatcyclus. OPMERKING: Vanwege de warmte die vrijkomt bij ultrasoonapparaat, is het uiterst belangrijk om ervoor te zorgen dat alle aliquots op ijs worden gehouden wanneer ze niet worden gesoniseerd. Het ijsbad moet constant worden aangevuld of groot genoeg zijn om koel te blijven gedurende het hele ultrasoonapparaatproces.</li>
	<li>Centrifugeer elke buis bij 18.000 x g en 4 °C gedurende 10 minuten. Haal het supernatant en aliquot in 1,5 ml microfugebuizen in 600 μL aliquots. Flash vries aliquots in en bewaar bij -80 °C tot verder gebruik. Er moet voor worden gezorgd dat alleen het supernatant wordt gepimpt.</li>
</ol>4. Celvrije eiwitsynthese
<ol><li>Ontdooi één aliquot extract uit de vorige stap om 15 μL celvrije eiwitsynthesereacties uit te voeren in 1,5 ml microfugebuizen in quadruplicaat.</li>
	<li>Bereid elke reactie voor door 240 ng DNA (16 μg/ml eindconcentratie), 2,20 μl oplossing A, 2,10 μl oplossing B, 5,0 μl extract en een wisselend volume water van moleculaire kwaliteit te combineren om de reactie te vullen tot 15 μL. Deze reactie kan worden geschaald naar hogere volumes. Zie tabel 3 voor ratio's.<ol>
<li>Bereid oplossing A en B voor volgens tabel 4. Elke oplossing kan worden bereid in batches van 100 μL tot 1 ml, aliquoteerd en bewaard bij -80 °C tot verder gebruik. OPMERKING: De hoeveelheid DNA kan variëren afhankelijk van het eiwit van belang. In dit geval is het gebruikte plasmide, pJL1-sfGFP, geoptimaliseerd om te presteren bij 16 μg / ml, of 597 μM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laat de reacties minstens 4 uur lopen bij 37 °C.</li>
</ol>5. Kwantificering van reporter eiwit, super folder groen fluorescerend eiwit (sfGFP)
<ol><li>Combineer met behulp van een half oppervlak 96-well zwarte polystyreenplaat 2 μL van elk celvrij eiwitsynthesereactieproduct met 48 μL van 0,05 M HEPES-buffer bij pH 7,2. Drie tot vier replicaties van elke reactiebuis worden aanbevolen.</li>
	<li>Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit van de sfGFP met een excitatiegolflengte van 485 nm en een emissiegolflengte van 528 nm.</li>
	<li>Voor de omzetting van relatieve fluorescentie-eenheden naar volumetrische opbrengst (μg/ml) sfGFP, stel een standaardcurve vast met behulp van gezuiverde pJL1-sfGFP.</li>
</ol>

<ol><li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li>
<li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li>
<li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+supplement+mixtures%3A+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li>
<li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li>
<li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+Protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882(2019).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22System+for+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable%2C+on-demand+biomolecular+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li>
<li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li>
<li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li>
<li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li>
<li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li>
<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663(2015).</li>
<li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li>
<li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li>
<li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li>
<li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li>
<li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li>
<li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlining+the+preparation+of+%22endotoxin-free%22+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li>
<li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li>
<li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li>
<li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system%3A+Practical+laboratory+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li>
<li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing%2C+stressed+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li>
<li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li>
<li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+A+highly+productive%2C+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li>
<li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li>
<li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangenconflicten hebben.

Toezicht door onderzoekers is traditioneel nodig voor twee belangrijke acties tijdens celgroei: de inductie van T7 RNAP en het oogsten van cellen bij een specifieke OD600. CFAI voorkomt beide vereisten om de tijd van de onderzoeker te verminderen en de technische training die nodig is om celextracten van hoge kwaliteit te bereiden. Auto-inductie van T7 RNAP wordt bereikt door glucose te vervangen door lactose als de primaire suiker in de media, waardoor de eerdere noodzaak om de groei actief te controleren en ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2,&#160;Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow

Het gebruik van celvrije eiwitsynthese (CFPS) voor biotechnologische toepassingen is de afgelopen jaren aanzienlijk toegenomen 1,2,3. Deze ontwikkeling kan gedeeltelijk worden toegeschreven aan de toegenomen inspanningen om de processen die zich voordoen in CFPS en de rol van elk onderdeelte begrijpen 4,5. Bovendien hebben lagere kosten als gevolg van geoptimaliseerde opstellingen en alternatieve energiebronnen celvrije technologie gemakkelijker te implementeren gemaakt voor nieuwe gebruikers 6,7,8,9. Om de noodzakelijke transcriptie- en translatiefactoren voor eiwitsynthese te implementeren, wordt celextract vaak gebruikt om celvrije reactiesaan te sturen 10. Onlangs gepubliceerde gebruikershandleidingen hebben eenvoudige protocollen voor het produceren van functioneel extract, waardoor het gemakkelijker te implementeren is voor zowel nieuwe als ervaren gebruikers 1,11,12,13,14. Celextract wordt meestal verkregen door de lysis van een celkweek, die kan worden gekweekt met behulp van verschillende organismen, afhankelijk van het specifieke gebruik dat gewenst is 1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) is snel uitgegroeid tot een van de meest gebruikte gastheerorganismen voor de productie van functionele extracten17. De BL21 Star (DE3) stam heeft de voorkeur omdat het de proteasen uit het buitenmembraan (OmpT protease) en het cytoplasma (Lon protease) verwijdert, waardoor een optimale omgeving wordt geboden voor de recombinante eiwitexpressie. Bovendien bevat de DE3 het λDE3 dat het gen voor T7 RNA-polymerase (T7 RNAP) draagt onder controle van de lacUV5-promotor; de stercomponent bevat een gemuteerd RNaseE-gen dat splitsing van mRNA 4,14,18,19 voorkomt. Onder de lacUV5-promotor maakt isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG) inductie de expressie van T7 RNAP20,21 mogelijk. Deze stammen worden gebruikt om cellen te kweken en te oogsten, die grondstof geven voor de bereiding van extracten. Cellyse kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende methoden, waaronder kralen kloppen, Franse pers, homogenisatie, ultrasoonapparaat en stikstof cavitatie 1,11,12,22.
Het proces van bacteriekweek en oogsten is consistent op de meeste platforms bij het gebruik van E. coli, maar vereist meerdere dagen en intensief toezicht van de onderzoeker 1,11,13. Dit proces begint over het algemeen met een nachtelijke zaadkweek in LB-bouillon, die bij nachtelijke groei vervolgens wordt ingeënt tot een grotere cultuur van 2xYTPG (gist, trypton, fosfaatbuffer, glucose) de volgende dag. De groei van deze grotere cultuur wordt gemonitord totdat deze de vroege tot midden logfase bereikt, bij een optische dichtheid (OD) van 2,514,20. Constante meting is vereist omdat eerder is aangetoond dat de componenten van transcriptie en translatie zeer actief zijn in de vroege tot midden logfase23,24. Hoewel dit proces reproduceerbare extracten kan creëren, heeft ons laboratorium onlangs een nieuwe methode ontwikkeld met behulp van Cell-Free Autoinduction (CFAI) Media, die het toezicht van onderzoekers vermindert, de totale opbrengst van extract voor een bepaalde liter celkweek verhoogt en de toegang tot E. coli-gebaseerde extractbereiding voor zowel ervaren als nieuwe gebruikers verbetert (figuur 1 ). Hier bieden we de stapsgewijze handleiding voor het implementeren van de CFAI-workflow, om binnen 24 uur van een gestreepte plaat cellen naar een voltooide CFPS-reactie te gaan.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL Microfuge Tubes</td><td>Phenix</td><td>MPC-425Q</td><td></td></tr><tr><td>1L Centrifuge Tube</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99028</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-E Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td><td>Biotek</td><td>BTCYT5F</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>D-Lactose</td><td>Alfa Aesar</td><td>J66376</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td></td></tr><tr><td>Folinic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000 Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>366754</td><td></td></tr><tr><td>K(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>K(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Aspartic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7219-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-Histadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Phenylalanine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptophan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754-100G</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>ThermoFisher</td><td>12795027</td><td></td></tr><tr><td>L-Valine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500-25G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Glu)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30134</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Grade Water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12313</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8535-15VL</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova 42/42R Incubator</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0000</td><td></td></tr><tr><td>NH4(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09689-250G</td><td></td></tr><tr><td>NTPs</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Oxalic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0963-100G</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860077-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Dibasic</td><td>Acros, Organics</td><td>A0382124</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Acros, Organics</td><td>A0379904</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Prep Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>K210007</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D13208-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>73049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>Tunair 2.5L Baffled Shake Flask</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z710822</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic Processor</td><td>QSonica</td><td>Q125-230V/50HZ</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>1/2/8013</td><td></td></tr></tbody></table>

van cellen naar celvrije eiwitsynthese binnen 24 uur met behulp van celvrije auto-inductieworkflow

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Celvrije eiwitsynthese (CFPS) is uitgegroeid tot een biotechnologisch platform dat transcriptie- en vertaalmachines in vitro vastlegt. Talrijke ontwikkelingen hebben het CFPS-platform toegankelijker gemaakt voor nieuwe gebruikers en hebben het scala aan toepassingen uitgebreid. Voor op lysaat gebaseerde CFPS-systemen kunnen celextracten worden gegenereerd uit een verscheidenheid aan organismen, waarbij de unieke biochemie van die gastheer wordt gebruikt om de eiwitsynthese te vergroten. In de afgelopen 20 jaar is Escherichia coli (E. coli) een van de meest gebruikte organismen geworden voor het ondersteunen van CFPS vanwege de betaalbaarheid en veelzijdigheid. Ondanks tal van belangrijke ontwikkelingen is de workflow voor de bereiding van E. coli-celextract een belangrijk knelpunt gebleven voor nieuwe gebruikers om CFPS voor hun toepassingen te implementeren. De workflow voor de voorbereiding van extracten is tijdrovend en vereist technische expertise om reproduceerbare resultaten te bereiken. Om deze barrières te overwinnen, meldden we eerder de ontwikkeling van een 24-uurs celvrije auto-inductie (CFAI) -workflow die de input van gebruikers en de vereiste technische expertise vermindert. De CFAI-workflow minimaliseert de arbeid en technische vaardigheden die nodig zijn om celextracten te genereren en verhoogt tegelijkertijd de totale hoeveelheden verkregen celextracten. Hier beschrijven we die workflow stap voor stap om de toegang te verbeteren en de brede implementatie van op E. coli gebaseerde CFPS te ondersteunen.

Bij het bereiden van CFAI-media werd glucose ingeruild voor een toename van lactose en glycerol als het belangrijkste energiesubstraat in de media. Daarnaast werd ook de buffercapaciteit van de CFAI-media verhoogd. Deze specifieke componenten zijn weergegeven in tabel 1.
De cellen werden vervolgens gekweekt tot zowel een OD600 van 10 als de standaard 2,5 in CFAI-media om consistentie met extractkwaliteit te tonen ondanks verschillende extracthoeveelheden. De 2,5 OD<...

Dit werk beschrijft de bereiding van celextract van Escherichia coli (E. coli) gevolgd door celvrije eiwitsynthese (CFPS) reacties in minder dan 24 uur. Uitleg van het celvrije auto-inductie (CFAI) protocol beschrijft verbeteringen die zijn aangebracht om het toezicht van onderzoekers te verminderen en de verkregen hoeveelheden celextract te verhogen.

Van cellen naar celvrije eiwitsynthese binnen 24 uur met behulp van celvrije auto-inductieworkflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

De celvrije auto-inductiemethode vermindert het toezicht van onderzoekers en de tijd die nodig is om functionele celextracten te produceren. Dit vereenvoudigt eerdere in vitro eiwitsyntheseprotocollen die tijdrovender en intensiever waren. Deze techniek is minder ingewikkeld en ook hoogproductief, waardoor een groter publiek celvrije expressie kan implementeren.Deze methode benadrukt het belang van energiemetabolisme tijdens celgroei en binnen celvrije reacties. Begin met het bereiden van 960 milliliter celvrije auto-inductiemedia. Steriliseer vervolgens de media in een verbijsterde kolf van 2,5 liter door gedurende 30 minuten te autoclaveren bij 121 graden Celsius.Vervolgens, na het bereiden van 40 milliliter van de suikeroplossing, filter-steriliseer het in een aparte geautoclaveerde glazen container. Na het autoclaveren, wanneer de kweekmedia zijn afgekoeld tot minder dan 40 graden Celsius, voegt u de filtergesteriliseerde suikeroplossing rechtstreeks aan de media toe. Ent vervolgens de media door een lus vol kolonies van een eerder gestreepte verse E.coli BL21-sterplaat te vegen en de lus rechtstreeks in de media in te brengen.Draai de lus in het medium zonder de zijkanten van

from-cells-to-cell-free-protein-synthesis-within-24-hours-using-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Deze vijfdaagse protocol beschrijft alle stappen, apparatuur en aanvullende software voor het maken en uitvoeren van een efficiënte endogene Escherichia coli op basis TX-TL-cel-vrije expressie systeem vanaf nul. Met reagentia, het protocol duurt 8 uur of minder voor het inrichten van een reactie, verzamelen en verwerken van gegevens.

Protocollen voor implementatie van een Escherichia coli Op basis TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Een microfabricageapparaat met afsluitbare reactiekamers van femtolitervolume wordt beschreven. Dit rapport bevat een protocol voor het afsluiten van celvrije eiwitsynthesereactanten in deze kamers met als doel het begrip van de rol van overbevolking en beperking bij genexpressie.

Afsluitbare Femtoliter Kamer Arrays voor Celvrije Biology

Op een ondergrond, die kan worden gebruikt voor het uitvoeren van cel-vrije gen expressie experimenten op biochips beschrijven we een eenvoudige lithografische procedure voor de immobilisatie van gen-lengte DNA moleculen.

Functionele oppervlak-immobilisatie van genen met behulp van meerstaps Strand Displacement lithografie

Dit protocol detailleert de stappen, kosten, en apparatuur die nodig is voor het genereren van E. coli-op basis van cel extracten en uit te voeren in vitro eiwit synthese reacties binnen 4 dagen of minder. Om de invloed van de flexibele aard van dit platform voor brede toepassingen, bespreken we reactie voorwaarden die kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd.

Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

Dit protocol beschrijft de methode, materialen, apparatuur en stappen voor bottom-up voorbereiding van RNA en eiwit produceren synthetische cellen. Het binnenste waterige compartiment van de synthetische cellen bevatte de S30 bacteriële lysaat ingekapseld in een lipide tweelaag (dat wil zeggen, stabiele liposomen), met behulp van een water-in-olie emulsie overdracht methode.

Voorbereiding van eiwit producerende synthetische cellen met behulp van cell free bacteriële extracten, liposomen en emulsie transfer

De studie beschrijft een protocol voor het maken van grote (μg-mg) hoeveelheden DNA voor eiwitscreeningcampagnes uit synthetische genfragmenten zonder klonen of het gebruik van levende cellen. De minimale sjabloon wordt enzymatisch verteerd en gecicirkeld en vervolgens versterkt met behulp van isothermische rollende cirkelversterking. Celvrije expressiereacties konden worden uitgevoerd met het ongezuiverde product.

Snelle, enzymatische methoden voor versterking van minimale, lineaire sjablonen voor eiwitprototypering met behulp van celvrije systemen

Goed gekarakteriseerde genetische delen zijn noodzakelijk voor het ontwerp van nieuwe genetische circuits. Hier beschrijven we een kosteneffectieve, high-throughput methode voor het snel karakteriseren van genetische delen. Onze methode vermindert kosten en tijd door celvrije lysaten, lineair DNA om klonen te voorkomen en akoestische vloeistofverwerking te combineren om de doorvoer te verhogen en reactievolumes te verminderen.

Snelle karakterisering van genetische delen met celvrije systemen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bereiding en bufferkalibratie van celextracten uit exonuclease V knock-out stammen van Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD en ΔrecB). Dit is een snelle, eenvoudige en directe benadering voor expressie in celvrije eiwitsynthesesystemen met behulp van lineaire DNA-sjablonen.

Celvrije eiwitsynthese uit exonuclease-deficiënte cellulaire extracten met behulp van lineaire DNA-sjablonen

Dit protocol beschrijft het Cell-Free Protein Synthesis (CFPS)-systeem dat wordt gebruikt bij het bouwen van synthetische cellen. Het schetst de belangrijkste fasen met representatieve resultaten in verschillende microcompartimenten. Het protocol heeft tot doel best practices vast te stellen voor diverse laboratoria in de synthetische celgemeenschap, waardoor de vooruitgang in de ontwikkeling van synthetische cellen wordt bevorderd.

Celvrij eiwitsynthesesysteem voor het bouwen van synthetische cellen

Een nieuwe generatie van cel-vrije transcriptie-vertaling platforms is ontworpen voor de bouw van biochemische systemen in vitro middels het uitvoeren van gene circuits. In dit artikel beschrijven we hoe bacteriofagen, zoals MS2, ΦΧ174 en T7, worden gesynthetiseerd uit hun genoom met behulp van een alle E. coli cel-vrije TXTL systeem.

Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie

Leer een vereenvoudigde celvrije auto-inductiemethode voor functionele celextracten uit Escherichia coli. Deze techniek vermindert onderzoekerstoezicht en tijd, waardoor celvrije eiwitsynthese toegankelijker wordt voor breder onderzoek.

Van cellen naar celvrije eiwitsynthese binnen 24 uur met behulp van celvrije auto-inductieworkflow

Meer video's verkennen