Van cellen naar celvrije eiwitsynthese binnen 24 uur met behulp van celvrije auto-inductieworkflow

De celvrije auto-inductiemethode vermindert het toezicht van onderzoekers en de tijd die nodig is om functionele celextracten te produceren. Dit vereenvoudigt eerdere in vitro eiwitsyntheseprotocollen die tijdrovender en intensiever waren. Deze techniek is minder ingewikkeld en ook hoogproductief, waardoor een groter publiek celvrije expressie kan implementeren.

Deze methode benadrukt het belang van energiemetabolisme tijdens celgroei en binnen celvrije reacties. Begin met het bereiden van 960 milliliter celvrije auto-inductiemedia. Steriliseer vervolgens de media in een verbijsterde kolf van 2,5 liter door gedurende 30 minuten te autoclaveren bij 121 graden Celsius.

Vervolgens, na het bereiden van 40 milliliter van de suikeroplossing, filter-steriliseer het in een aparte geautoclaveerde glazen container. Na het autoclaveren, wanneer de kweekmedia zijn afgekoeld tot minder dan 40 graden Celsius, voegt u de filtergesteriliseerde suikeroplossing rechtstreeks aan de media toe. Ent vervolgens de media door een lus vol kolonies van een eerder gestreepte verse E.coli BL21-sterplaat te vegen en de lus rechtstreeks in de media in te brengen.

Draai de lus in het medium zonder de zijkanten van de container aan te raken. Plaats vervolgens de ingeënte media een nacht in een incubator van 30 graden Celsius met schudden bij 200 RPM. Oogst de volgende dag de cellen door een liter van het medium over te brengen in een centrifugefles van één liter en centrifugeer op 5.000 keer G tussen vier en 10 graden Celsius gedurende 10 minuten.

Gebruik na het weggooien van het supernatant een steriele spatel om de pellet over te brengen naar een voorgekoelde en eerder gewogen conische buis van 50 milliliter. Was de pellet vervolgens eenmaal met 30 tot 40 milliliter koude S30-buffer door de pellet via vortexing in bursts van 30 seconden met rustperioden op ijs opnieuw te suspenderen. Nadat de pellet volledig is geresuspendeerd, centrifugeert u de celreuspensie, gooit u het supernatant weg en veegt u met een schoon weefsel overtollig supernatant van de binnenwanden van de 50-milliliterbuis af zonder de pellet aan te raken.

Weeg vervolgens de pellet voordat u deze invriest in vloeibare stikstof en bewaar deze bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. Om het celextract te bereiden, voegt u één milliliter S30-buffer per gram bevroren celkorrel toe en laat u de pellet 30 tot 60 minuten op ijs ontdooien. Resuspend de ontdooide pellet vervolgens via vortexing in uitbarstingen van 30 seconden met rustperioden op ijs totdat er geen zichtbare celklonten overblijven.

Breng voor cellysis 1,4 milliliter aliquots van de celsuspensie over in microfugebuizen van 1,5 milliliter. Soniceer vervolgens de celsuspensie in elke buis met een frequentie van 20 kilohertz en 50% amplitude gedurende drie uitbarstingen van 45 seconden met 59 seconden rust per cyclus in een ijsbad Keer de buis tussen cycli om en voeg na de laatste ultrasoonapparaatcyclus onmiddellijk 4,5 microliter één molair dithiothreitol toe. Na het soniceren van de celsuspensie in alle buizen, centrifugeer de buizen en verzamel het supernatant in aliquots van 600 microliter in verse 1,5-milliliter microfugebuizen.

Flash bevries en bewaar de aliquots bij min 80 graden Celsius tot verder gebruik. Om 15 microliter celvrije eiwitsynthesereactie uit te voeren in microfugebuizen van 1,5 milliliter in quadruplicaat, ontdooit u één aliquot van het celextract. Laat na het bereiden van elk 15-microliter reactiemengsel de reactie minstens vier uur lopen bij 37 graden Celsius.

Om het reporter-eiwit te kwantificeren, combineert u 48 microliter 50-millimolaire HEPES-buffer bij pH 7,2 met twee microliter van elk celvrij eiwitsynthesereactieproduct in een zwarte polystyreen 96-well plaat. Kwantificeer de fluorescentie-intensiteit van het superfolder groene fluorescerende eiwit, of sfGFP, met behulp van een excitatiegolflengte van 485 en een emissiegolflengte van 528 nanometer. Converteer vervolgens de relatieve fluorescentie-eenheden naar de volumetrische opbrengst van sfGFP door een standaardcurve te maken met behulp van gezuiverd pJL1 sfGFP-plasmide.

Hier worden celvrije auto-inductiemediapellets getoond na celoogst bij verschillende optische dichtheden gemeten bij 600 nanometer. De media groeiden tot een optische dichtheid van 10 produceerden een hogere hoeveelheid celkorrel in totaal extract dan de media groeiden tot een optische dichtheid van 2,5. Verdere analyse van de totale eiwitconcentratie toonde geen significant verschil in totaal eiwit tussen beide extracten.

Hoewel de media werden gekweekt tot verschillende optische dichtheidsniveaus, vertoonden beide extracten vergelijkbare resultaten in celvrije reacties die sfGFP tot expressie brachten. Het handhaven van steriele omstandigheden tijdens het bereiden van de media en suikeroplossing is belangrijk. Deze CFAI-celextractmethode kan worden gebruikt voor de meeste toepassingen van celvrije expressie.

Deze variëren van biotechnologisch onderwijs tot eiwittechnologie, evenals point-of-care diagnostiek. Deze methode vermindert de hoeveelheid tijd en technische vaardigheden die nodig zijn, verbetert de reproduceerbaarheid en produceert grotere hoeveelheden extract.