בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים

פרוטוקול זה נועד להשיג כמויות גבוהות של מקרופאגים לא מגורה שמקורם במח עצם ומעולם לא נחשפו לגורמי רקמה או ציטוקינים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא מספר התאים שנרכשו מחיה אחת. עם ההליך הנכון, בערך 2 פעמים 10 בחזקת 7 מקרופאגים ניתן להשיג.

שיטה זו יכולה לסייע לחוקרים מתחומים שונים החוקרים מקרופאגים כגון ביולוגיה של התא, פתולוגיה, אימונולוגיה ופרזיטולוגיה, מכיוון שתאים תמיד רגישים לזיהום, זהירות בכל השלבים הסטריליים ושימוש בארון בטיחות ביולוגית של זרימה למינרית נחוצים כדי לשמור על כדאיות התא. מי שתדגים את ההליך תהיה איזבלה אפארסידה דה סוזה. סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלנו.

כדי להתחיל את ההליך על עכבר זכר מסוג פרא C57BL/6 בן שמונה שבועות שעבר המתת חסד נכונה, השרו את העכבר בתמיסת אתנול 70%. בעזרת מספריים סטריליים, לבצע חתך של סנטימטר אחד לאורך הבטן ולהסיר את העור עד שריר הרגליים האחוריות נחשף במלואו. לאחר מכן הסר בזהירות את הרגליים האחוריות בגובה הירך מבלי לשבור את עצם הירך והשוקה.

הכניסו את הרגליים האחוריות השלמות לצינור צנטריפוגה חרוטי המכיל תמיסת אתנול 70%. בתוך ארון בטיחות ביולוגית של זרימה למינרית, העבירו את הרגליים המבודדות מאתנול 70% ל-PBS סטרילי. בעזרת מלקחיים ומגבוני חיטוי, נקו את העצמות על ידי הסרת כל השרירים המחוברים והפאשיה.

לאחר מכן, השתמש בלהב אזמל כירורגי סטרילי כדי לחתוך את אפיפיזה העצם משני קצותיה, לחשוף את מח העצם. מלאו מזרק של 20 מיליליטר בתמיסת PBS סטרילית של 10 מיליליטר בתוספת תמיסת סטרפטומיצין פניצילין 2%, וחברו אליו מחט של 26 מד. החזיקו את העצם באמצעות מלקחיים אנטומיים ביד אחת.

השתמש ביד השנייה כדי להחדיר את המחט לתוך חלל העצם בזהירות מבלי למחוץ את העצם. לאחר מכן, לשטוף את החלק הפנימי של העצם עם PBS ולאסוף את מח העצם בצינור צנטריפוגה חרוטי סטרילי. לאחר שטיפה, חלל העצם צריך להיראות לבן.

צנטריפוגה את התאים שנאספו ב 300G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את כדורית התא במיליליטר אחד של מדיום DMEM/F1210. הומוגניזציה של המתלה ולהוסיף עוד תשעה מיליליטר של המדיום כדי להביא את הנפח הכולל עד 10 מיליליטר.

הוסיפו מיליליטר אחד של מתלה תאי האב לכל אחת מ-10 צלחות פטרי עגולות מפלסטיק, בגודל 100 מיליליטר על 20 מילימטרים. מפזרים את התאים על פני הלוחות עם פיפטה כדי לקבל פיזור אחיד. לאחר מכן, הוסף תשעה מיליליטר של DMEM/F1210 בתוספת 20% של תא L929 supernatant לכל מנה.

דוגרים על הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. ביום השלישי, יש להוסיף 10 מיליליטר של מדיום DMEM/F1210 בתוספת 20% של סופרנאטנט תאי L929 לכל מנה. 20 מיליליטר של מדיום תרבית בכל מנה מספיקים לצמיחת תאים עד להבשלה.

השליכו את הסופרנאטנטים מכל מנות התרבות. שטפו כל צלחת תרבית עם 10 מיליליטר של PBS סטרילי נטול מגנזיום וסידן, שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס, והשליכו את התמיסה לאחר הכביסה. הוסיפו שלושה מיליליטר של תמיסת דיסוציאציה תאית לא אנזימטית, שחוממה מראש ל-37 מעלות צלזיוס לכל מנה.

יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן, השתמשו במיקרוסקופ הפוך כדי לדמיין אם המקרופאגים מתנתקים מכלי תרבית התא. באמצעות פיפטה סרולוגית, שטפו את הכלים בתמיסת הדיסוציאציה התאית הלא אנזימטית, ובצעו שוב ושוב תנועות מעגליות כדי להבטיח דיסוציאציה מלאה של המקרופאגים.

אוספים ומשלבים את התמיסה מכל מנות התרבות לצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מיליליטר. שוב, הוסיפו 10 מיליליטר של PBS סטרילי שחומם מראש לצלחות התרבית הריקות. צנטריפוגה את הצינור החרוטי המכיל את התמיסה המשולבת שנאספה ב 300G וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את הגלולה עם מיליליטר אחד של DMEM/F1210. הומוגניזציה של המתלה לאט ובזהירות על ידי פיפטציה שלו למעלה ולמטה מבלי לפגוע בתאים. לדלל aliquot 10 מיקרוליטר של תמיסת מקרופאגים על ידי הוספת 10 מיקרוליטר של כחול טריפאן כדי לספור את התאים באמצעות המוציטומטר.

ביום השביעי, כל מנה תפיק כ-2 מיליון מקרופאגים. חשיפה לגורם מעורר מושבת מקרופאגים מסופרנאטנט L929 הפכה בהדרגה את אבות מח העצם למקרופאגים בוגרים, והציגה מורפולוגיה מפוזרת אופיינית עקב שלוחות ציטופלזמיות. ביום השלישי הופיעו כמה מקרופאגים לא בשלים, בעלי מורפולוגיית צורה עגולה טיפוסית עם מעט הטלות ממברנה.

למרות שהם השתנו לאורך כל התהליך, שבעה ימים היו נחוצים כדי להשיג מספר ובשלות נאותים. המקרופאגים שהתקבלו הציגו אוכלוסייה הומוגנית במונחים של גודל וגרעיניות בניתוח ציטומטריית הזרימה. יתר על כן, 100% מהאוכלוסייה ביטאו את מולקולות פני השטח האופייניות F480 ו- CD11B, ויצרו אוכלוסייה אחת מוגדרת היטב של תאים.

יכולת הפאגוציטוזה של המקרופאגים הבוגרים והממוינים היטב אושרה על ידי תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המראות טפילי לישמניה פגוציטוזים עיקריים בתוך המקרופאגים. יש להסיר את הרגליים מהחיה בזהירות מכיוון שהיא מבוצעת בסביבה לא סטרילית והיא המקור החשוב ביותר לזיהום. אין לשבור רגליים מחוץ לארון הבטיחות הביולוגית של הזרימה הלמינרית.

המקרופאגים שמקורם במח עצם המתקבלים מפרוטוקול זה יכולים לשמש לאחר מכן לביצוע קיטוב מקרופאגים במבחנה כדי להבין את הפיזיולוגיה של המקרופאגים.